高效液相層析法（HPLC）
高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。
1. 高效液相層析儀典型的高效液相層析儀
包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測系統(tǒng)三部分。流動相用一高壓泵輸入。
這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：
（1）流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。
（2）能抗溶劑腐蝕。
（3）有較高的輸出壓力，一般要達(dá)到15~300 kg/c，也有的高達(dá)800 kg/c
（4）泵的死體積要小。
梯度洗脫裝置必須具備兩臺高壓泵，一臺輸送強(qiáng)溶劑，一臺輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動相的組成，以改善分離效果。
一般用微量注射器直接進(jìn)樣，也可采用六通閥門進(jìn)樣。HPLC中所用的檢測器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達(dá)ng水平。此外，還有熒光檢測器、示差析光檢測器、電化學(xué)檢測器等。
2. HPLC的類型與應(yīng)用
（1）液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。
流動相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。
（2）液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學(xué)鍵合相層析。
另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。化學(xué)鍵合層析分：
①極性鍵合相層析：固定相為極性基團(tuán)，氰基、氨基及雙羥基三種。流動相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。
②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團(tuán)，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機(jī)鹽緩沖液。
最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。
離子對分配層析分：
①正相離子對層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。
流動相為極性較低的有機(jī)溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機(jī)相中進(jìn)行分配，而達(dá)到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是流動相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。
②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對離子同時存在于強(qiáng)極性的流動相中，生成的中性離子對在流動相和鍵合相之間進(jìn)行分配，而得到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。
（3）離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的pK值附近。
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