磷硫鐵法測(cè)定血清膽固醇
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.掌握磷硫鐵法測(cè)定血清膽固醇的原理與方法。
2.深入了解血清膽固醇的性質(zhì)及其在體內(nèi)的代謝。
二、實(shí)驗(yàn)原理
血清經(jīng)無(wú)水甲醇處理后蛋白質(zhì)被沉淀，膽固醇則溶解在無(wú)水甲醇中。甲醇提取液與硫磷鐵試劑反應(yīng)后生成有色物質(zhì)，其呈色度與膽固醇含量成正比，可于550nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。正常血清中膽固醇的含量有隨年齡增大而增加的趨勢(shì)，其平均正常值在l10～220mg/100mL。
三、儀器和試劑
儀器
722分光光度計(jì) 、臺(tái)式離心機(jī)、具塞錐形瓶等。
試劑
1．1.0mg/mL 膽固醇貯存液：將100.0mg 膽固醇溶于100mL 無(wú)水甲醇中。
2. 0.02mg/mL 膽固醇工作掖：取2mL 膽固醇貯存液加98mL 無(wú)水甲醇。
3. 三氯化鐵溶液：5.0g FeCl3·6H2O 溶于200mL 濃磷酸中。
4. 磷硫鐵試劑(P-S-Fe 試劑)：取40mL 的三氯化鐵溶液用濃硫酸定容到500mL。
四、操作步驟
1.取兩支帶帽試管，各加入0.1mL 血清和10mL 無(wú)水甲醇，立即用力振蕩(或Vortex mixer 上混10s)。
2.將兩支試管于臺(tái)式離心機(jī) 上高速(3000rpnI)離心5min。各取2.0mL 上清液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的錐形瓶
中。
3.取0.02mg/mL 膽固醇工作液2.0mL 轉(zhuǎn)移到第三個(gè)錐形瓶中，用作標(biāo)準(zhǔn)。
4.取2.0mL 甲醇加入到第四個(gè)錐形瓶中，用做空白。
5.向4個(gè)錐形瓶中緩慢加入2.0mL 的磷硫鐵試劑，輕輕振蕩均勻。
6.封住錐形瓶口，置室溫30min，所生顏色在1h 內(nèi)穩(wěn)定。
7.將上述各錐瓶中的有色溶液于550nm 下進(jìn)行比色測(cè)定，作記錄。.
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