陸軍軍醫大學 Science Advances 文章分享|炎癥引發的自焚結合物通過克服胃腸道屏障實現口服肽的遞送
摘要：
由于胃腸（GI）降解和腸道吸收不良，肽類藥物口服傳遞仍然具有挑戰性。本研究提出一種自焚肽前藥偶聯（SIPPC）平臺用于炎癥靶向口服遞送，集成了親水聚乙二醇段、對ROS反應的活性氧物質自焚模塊以及可水解支架，這些結構共同實現膠束樣納米顆粒的自發組裝。利用三種抗炎肽（KPV、Ac-QAW和IRW），我們證明了工程結合物在炎癥部位表現出顯著的胃腸道穩定性、高效的黏液穿透和ROS響應釋放能力。在結腸炎小鼠中，基于KPV的結合物（proKPV）結腸積聚量比游離KPV高出3.8倍，即使在降低20倍劑量下療效也更強。除了結腸炎模型中的治療效果外，口服proKPV在炎癥肺部中積累了大量藥物，并在急性肺損傷小鼠中表現出強效的抗炎效果。基于AC-QAW和IRW的偶聯物表現出相似的益處，凸顯了SIPPC作為口服肽治療的變革范式，為炎癥性疾病的臨床轉化帶來了巨大潛力。
文章主體：
本文介紹了一種自焚肽前藥偶聯（SIPPC）策略用于炎癥靶向肽遞送，專為口服給藥于炎癥組織而設計。理性工程的共軛物由四個關鍵組成部分組成：親水鏈、對炎癥反應的疏水自焚部分、生物活性肽載荷以及可水解支架。其兩親性特性使得膠束狀NPs能夠自組裝成，將肽包裹在疏水核心內，從而在口服后保護肽免受惡劣的胃腸環境影響。關鍵是，表面暴露的親水鏈促進了穿透黏液和上皮屏障的雙重穿透。為驗證該方法，我們使用了三種候選抗炎肽。以潰瘍性結腸炎一種代表性的炎癥性腸病（IBD）和急性肺損傷（ALI）作為疾病模型。值得注意的是，結腸炎和ALI均以局部氧化應激為特征，這是這些炎癥性疾病進展的關鍵病理特征。病變組織中病理性ROS過量產生為口服ROS響應的自焚系統提供了傳遞肽治療藥物的窗口。在炎癥部位，ROS觸發疏水單元的水解，暴露出羧基團，啟動支架自焚。這一級聯反應最終以精確控制釋放的純凈治療肽，其療效優于游離肽，并采用臨床使用的陽性對照。
炎癥響應自降解肽前藥proKPV的設計、合成與表征
設計了一種炎癥響應型自降解肽前藥結合物（SIPPC），以KPV三肽為模型藥物。該結合物由親水性聚乙二醇鏈、活性氧響應疏水自降解模塊（PBE）和可水解支架（六氯環三磷腈，HCCP）組成。通過親核反應將PEG-NH?、甘氨酸連接的PBE（Gly-PBE）和KPV依次連接到HCCP上，得到兩親性前藥proKPV。核磁共振和紅外光譜證實結構正確，每個proKPV分子含有一條PEG鏈、四個PBE單元和一個KPV。在過氧化氫存在下，proKPV可完全水解為可排泄的小分子（頻哪醇、對羥基苯甲醇、甘氨酸、磷酸根、PEG和游離KPV），表明其ROS響應性自降解能力。proKPV的自組裝、體外釋放及穩定性
proKPV在水中自組裝形成粒徑約81 nm、ζ電位約2.9 mV的球形納米粒，臨界膠束濃度約為49 μg/mL，在水、生理鹽水、PBS和胎牛血清中穩定性良好。體外釋放實驗顯示，在含1 mM H?O?的PBS中，proKPV在24小時內幾乎完全釋放KPV；而在不含H?O?的PBS中釋放緩慢。在模擬胃液中2小時僅釋放約9%的KPV，轉入含H?O?的模擬腸液后釋放顯著加快。將游離KPV和proKPV分別置于模擬胃液或腸液中孵育2小時后，HPLC顯示游離KPV幾乎完全降解，而proKPV保持完整。將經胃腸液處理后的proKPV與LPS刺激的巨噬細胞共孵育，仍能顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，而游離KPV則喪失抗炎活性。表明proKPV可保護KPV免受胃腸道降解，并在ROS條件下釋放活性肽。proKPV在炎癥細胞中的體外生物學效應
使用Cy5標記的proKPV納米粒觀察中性粒細胞攝取，呈時間和劑量依賴性。在PMA刺激的中性粒細胞中，proKPV劑量依賴性地抑制髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶和胞外dsDNA的釋放，降低瓜氨酸化組蛋白H3水平，減少NETosis。同時，proKPV顯著抑制PMA誘導的ROS生成和中性粒細胞遷移。在RAW264.7巨噬細胞中，proKPV同樣抑制PMA誘導的ROS生成，減輕ROS介導的細胞凋亡，并顯著降低LPS刺激的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌。以上效果均優于等劑量游離KPV。口服proKPV納米粒在結腸炎小鼠中的結腸滲透能力
通過多粒子追蹤技術，proKPV納米粒在新鮮腸道黏液中的擴散速度和均方位移顯著高于聚苯乙烯納米粒，表明其優異的黏液穿透能力。結腸炎小鼠口服Cy5-proKPV后6小時，共聚焦顯微鏡顯示熒光深入結腸黏膜各層，而游離Cy5-KPV僅局限于表層。證明proKPV納米粒能有效穿透黏液層并滲透至結腸組織深處。口服proKPV在結腸炎小鼠中的生物分布與結腸靶向
DSS誘導的結腸炎小鼠口服Cy5-proKPV后6小時，離體成像顯示結腸熒光信號顯著高于健康小鼠，且隨時間延長，proKPV在結腸的滯留可持續24小時，AUC較游離Cy5-KPV提高3.8倍。血液中亦檢測到持續至24小時的熒光信號。結腸組織切片免疫熒光顯示，proKPV與CK18?腸上皮細胞、CD68?巨噬細胞和Ly6G?中性粒細胞共定位，尤其在巨噬細胞和中性粒細胞中富集。proKPV在急性結腸炎小鼠中的治療效果、安全性及機制研究
DSS誘導的結腸炎小鼠每日口服proKPV（0.5或2.5 mg/kg）連續7天，顯著減輕體重下降、降低疾病活動指數、改善結腸縮短。迷你內鏡和病理切片顯示proKPV治療組結腸黏膜損傷明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少，杯狀細胞和黏液層恢復。免疫熒光顯示proKPV上調CK18、occludin和ZO-1表達，修復腸屏障功能；FITC-葡聚糖實驗證實腸道通透性降低。proKPV治療顯著降低結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO、MDA和ROS水平，抑制中性粒細胞浸潤和NETosis，促進CD206? M2巨噬細胞和FOXP3? Treg細胞增多。2.5 mg/kg proKPV療效優于50 mg/kg臨床藥物5-氨基水楊酸。安全性評估顯示proKPV對主要器官無毒性，血常規和肝腎功能指標正常，細胞實驗顯示高濃度下無細胞毒性。口服proKPV在急性肺損傷小鼠中的血液循環、肺靶向及治療效果
LPS誘導的ALI小鼠口服Cy5-proKPV后，血漿熒光逐漸升高，4小時達峰，持續至12小時；肺部熒光信號亦隨時間增強，12小時仍可檢測。而靜脈注射游離Cy5-KPV的血漿和肺熒光快速下降。治療實驗中，口服proKPV（2.5或10 mg/kg）顯著降低肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6、H?O?、MDA和MPO水平，減少支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞計數，改善肺組織病理損傷（炎癥浸潤和肺泡出血）。游離KPV（等效10 mg/kg）效果不明顯。基于Ac-QAW和IRW的兩親性肽前藥結合物的構建與表征
將上述策略拓展至抗炎肽Ac-QAW和IRW，分別合成proQAW和proIRW。兩者在水中自組裝形成粒徑約92 nm和84 nm的納米粒，ζ電位接近中性，CMC分別為43和107 μg/mL，在不同溶液中穩定性良好。proQAW和proIRW在結腸炎小鼠中的治療效果與安全性
proQAW和proIRW（2.5 mg/kg）口服治療DSS結腸炎小鼠，顯著減輕體重下降、降低DAI、改善結腸縮短，組織病理顯示結腸結構恢復，PAS染色示黏液分泌增加，免疫熒光示CK18、occludin和ZO-1表達上調。結腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO、H?O?和MDA水平顯著降低，中性粒細胞浸潤和NETosis減少，CD206? M2巨噬細胞增多。游離Ac-QAW或IRW（0.25 mg/kg）療效甚微。安全性評估顯示proQAW和proIRW對主要器官、血常規、肝腎功能無影響，胃腸組織無損傷，細胞毒性低。
綜上，該研究建立了一種炎癥觸發的自降解肽前藥平臺，通過合理設計的兩親性結合物，實現口服抗炎肽的胃腸道保護、黏液穿透、炎癥靶向富集和ROS響應釋放，在結腸炎和急性肺損傷模型中均展現顯著療效，并具有良好安全性。該策略具有普適性，為口服肽類藥物遞送提供了新范式。
