浙江大學(xué) 西南大學(xué) Science Advances 文章分享|受細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)啟發(fā)的口服肽-益生菌遞送通過自噬和腸道穩(wěn)態(tài)緩解IBD并發(fā)癥

發(fā)布日期：2026-03-27 14:24:06

浙江大學(xué) 西南大學(xué) Science Advances 文章分享|受細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)啟發(fā)的口服肽-益生菌遞送通過自噬和腸道穩(wěn)態(tài)緩解IBD并發(fā)癥

摘要：

腸道纖維化是炎癥性腸病的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前仍缺乏有效臨床治療方案。盡管LL37抗菌肽和益生菌對(duì)腸道纖維化具有治療潛力，但酶水解和快速清除作用限制了其臨床應(yīng)用。本研究受細(xì)菌遞送細(xì)菌素策略啟發(fā)，構(gòu)建了一種口服生物治療平臺(tái)BTB-海藻酸鹽。該平臺(tái)具有"一體化"結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)LL37和益生菌的時(shí)空協(xié)同遞送。BTB-海藻酸鹽通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能和重塑腸道菌群，有效修復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)。特別值得關(guān)注的是，整合多組學(xué)分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示，LL37通過誘導(dǎo)腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白介導(dǎo)的自噬發(fā)揮抗纖維化作用，該機(jī)制已在臨床標(biāo)本中得到驗(yàn)證。BTB-海藻酸鹽在急性結(jié)腸炎、炎癥性腸病相關(guān)纖維化和艱難梭菌相關(guān)性結(jié)腸炎三種小鼠模型中均表現(xiàn)出顯著療效，凸顯其作為炎癥性腸病治療范式的潛力。本研究為廣泛的胃腸道疾病治療提供了具有臨床轉(zhuǎn)化前景的策略。

圖1.BTB-Alg的仿生構(gòu)建用于炎癥性腸病治療：炎癥、纖維化狹窄和艱難梭菌感染。

（A）仿生設(shè)計(jì)BTB生物復(fù)合材料。（B）通過微生物擬態(tài)在胃腸道內(nèi)口服遞送益生菌和LL37的保護(hù)機(jī)制。（C）口服后，BTB-Alg會(huì)經(jīng)歷連續(xù)腸道粘連、載荷釋放、組織穿透及病灶特異性靶向。（D） BTB-Alg能緩解AC癥狀，解決纖維化，并抑制艱難梭菌感染（CDI）。（E）BTB-Alg介導(dǎo)的腸道生態(tài)位重編程機(jī)制。

文章主體：

本研究聚焦于炎癥性腸病（IBD）的嚴(yán)重并發(fā)癥——腸纖維化（IF）的臨床治療困境。腸纖維化作為IBD最常見的并發(fā)癥，發(fā)生率超過50%，卻缺乏有效治療手段。當(dāng)前臨床藥物雖能在一定程度上控制炎癥，但難以阻止纖維化進(jìn)程，患者常因腸梗阻需反復(fù)手術(shù)，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。該病的病理機(jī)制復(fù)雜，涉及腸道微環(huán)境中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫紊亂及菌群失調(diào)等多重因素共同刺激腸道成纖維細(xì)胞活化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。因此，單一靶點(diǎn)的干預(yù)策略難以奏效，亟需一種能同時(shí)調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞活性并恢復(fù)腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的綜合治療方案。

LL37作為一種源自抗菌肽的活性分子，在前期研究中展現(xiàn)出抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抑制成纖維細(xì)胞活化的潛力，但口服給藥面臨胃腸道酶解和快速清除的挑戰(zhàn)。受細(xì)菌分泌細(xì)菌素的自然現(xiàn)象啟發(fā)，研究者創(chuàng)新性地構(gòu)建了"益生菌-LL37-海藻酸鹽"一體化遞送平臺(tái)（BTB-Alg）。該仿生設(shè)計(jì)不僅利用益生菌作為天然載體實(shí)現(xiàn)LL37的腸道靶向遞送，更通過二者的協(xié)同作用，旨在同時(shí)干預(yù)效應(yīng)細(xì)胞（肌成纖維細(xì)胞）和致病微環(huán)境（炎癥、免疫、菌群），為IBD及其并發(fā)癥的治療提供新的臨床轉(zhuǎn)化策略。

以下是論文結(jié)果與分析部分的詳細(xì)總結(jié)：

1、LL37的體外特性研究

首先評(píng)估了LL37的抗纖維化效果：在TGF-β刺激的腸道成纖維細(xì)胞（CCD-18Co）中，LL37（1.11 μM）顯著降低α-SMA、Col1α1和FN的mRNA及蛋白表達(dá)，表明其能有效抑制成纖維細(xì)胞活化和ECM分泌。毒性試驗(yàn)顯示，LL37在22.3 μM以下對(duì)HT29細(xì)胞、靜息或活化的成纖維細(xì)胞均無明顯毒性，治療濃度遠(yuǎn)低于毒性閾值，安全性良好。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LL37更易被TGF-β活化的成纖維細(xì)胞攝取，提示其對(duì)病理狀態(tài)下的肌成纖維細(xì)胞具有內(nèi)在靶向性。此外，LL37處理后α-SMA免疫熒光強(qiáng)度下降，進(jìn)一步驗(yàn)證其抗活化作用。

2、BTB-Alg的設(shè)計(jì)與篩選

模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)顯示，LL37在胃酸中穩(wěn)定，但在胃蛋白酶中迅速降解，因此需保護(hù)性遞送。LL37對(duì)益生菌Lac的生長(zhǎng)在890 μM以下無明顯影響，確保共載可行性。通過逐層組裝，將FITC標(biāo)記的LL37與Lac共孵育，篩選出最佳裝載比為L(zhǎng)ac/LL6（每1×10? CFU Lac負(fù)載853 μg LL37）。隨后用海藻酸鈉（Alg）包被，形成Lac/LL@Alg。通過比較不同Alg濃度下的保護(hù)效果，確定Lac/LL@Alg-5為最優(yōu)配方，能在模擬胃液中有效防止LL37降解。

3、BTB-Alg的結(jié)構(gòu)表征與功能驗(yàn)證

Zeta電位和粒徑變化證實(shí)了逐層組裝的成功：Lac表面負(fù)電荷（-15.63 mV）在LL37吸附后變?yōu)檎姾桑?3.36 mV），再經(jīng)Alg包被后恢復(fù)為負(fù)電荷（-9.33 mV）。共聚焦顯微鏡顯示FITC-Lac、Cy3-LL37和Cy5-Alg三者共定位，形成清晰的核-殼結(jié)構(gòu)。XRD分析顯示LL37的特征峰在包被后消失，說明其被有效包埋。生長(zhǎng)曲線表明包被過程不影響Lac的活性。在模擬胃液中，Alg層保持完整，LL37釋放極少；轉(zhuǎn)入模擬腸液后，Alg逐漸解離，LL37逐步釋放，體現(xiàn)出pH響應(yīng)的控釋特性。平板計(jì)數(shù)也證實(shí)包被后的Lac在胃腸液中存活率顯著提高。

4、BTB-Alg在體內(nèi)的滯留與黏膜穿透能力

在DSS誘導(dǎo)的腸纖維化小鼠模型中，口服給予熒光標(biāo)記的Lac/LL@Alg后，IVIS成像顯示其在胃腸道內(nèi)滯留時(shí)間明顯長(zhǎng)于游離LL37或裸Lac。共定位信號(hào)顯示，Alg層在胃中完整，進(jìn)入腸道后逐漸解離，Lac和LL37信號(hào)持續(xù)存在至8小時(shí)以上。離體腸道組織成像顯示，BTB-Alg組在結(jié)腸黏膜的熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的2.79倍（Lac）和4.48倍（LL37）。在黏液穿透實(shí)驗(yàn)中，Lac/LL@Alg在24小時(shí)內(nèi)Lac穿透率達(dá)16.23%，LL37達(dá)48.17%，表現(xiàn)出良好的黏液滲透能力。在克羅恩病患者狹窄腸道組織中，BTB-Alg也能有效穿透組織。

5、BTB-Alg對(duì)急性結(jié)腸炎的治療效果

在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中，Lac/LL@Alg顯著緩解體重下降、降低疾病活動(dòng)指數(shù)、恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度、降低結(jié)腸重量指數(shù)。組織學(xué)顯示其減輕上皮損傷、減少免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、恢復(fù)杯狀細(xì)胞數(shù)量，降低組織學(xué)評(píng)分。炎癥因子TNF-α下降，IL-10升高，氧化應(yīng)激指標(biāo)MPO和MDA也顯著降低。16S rRNA測(cè)序顯示，Lac/LL@Alg恢復(fù)腸道菌群多樣性，增加有益菌（如norank_f_Muribaculaceae、Ligilactobacillus），減少致病菌（如Bacteroidota），并顯著富集Lac，說明其成功定植并重塑菌群。

6、BTB-Alg對(duì)艱難梭菌感染的結(jié)腸炎療效

在DSS聯(lián)合C. difficile感染的雙重模型中，Lac/LL@Alg顯著提高小鼠生存率，減輕體重下降，恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度，降低IL-6、IL-17、IL-1β mRNA水平。Western blot顯示ZO-1表達(dá)上調(diào)，腸道屏障功能恢復(fù)。組織學(xué)上，結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，未見潰瘍或隱窩膿腫。與萬古霉素相比，Lac/LL@Alg不僅減輕炎癥，還避免腸道菌群失調(diào)。免疫熒光顯示其抑制NF-κB通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1向M2極化。16S測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)其恢復(fù)菌群多樣性和結(jié)構(gòu)。

7、BTB-Alg對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的療效

在慢性DSS誘導(dǎo)的纖維化模型中，Lac/LL@Alg顯著改善體重恢復(fù)，延長(zhǎng)結(jié)腸長(zhǎng)度，降低纖維化評(píng)分。Masson染色和VG染色顯示其減少膠原沉積，免疫組化和免疫熒光顯示Col I和α-SMA表達(dá)下降，EMT標(biāo)志物vimentin減少，E-cadherin恢復(fù)。qPCR證實(shí)纖維化相關(guān)基因（α-SMA、Col1α1、FN）表達(dá)下調(diào)。體內(nèi)安全性評(píng)估未見明顯毒性。

8、BTB-Alg重塑腸道菌群功能

宏基因組分析顯示，Lac/LL@Alg處理組菌群結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組更接近，顯著富集有益菌（如Bacillota），減少致病菌（如Verrucomicrobiota）。KEGG功能分析顯示，纖維化相關(guān)通路（如LPS合成、ECM合成）下調(diào)，DNA修復(fù)通路（如核苷酸切除修復(fù)）和AMPK信號(hào)通路上調(diào)。VFDB分析顯示致病菌毒力因子減少。相關(guān)性分析表明，Lactobacillus豐度與體重、結(jié)腸長(zhǎng)度正相關(guān)，與纖維化評(píng)分、MPO、TNF-α負(fù)相關(guān)。

9、BTB-Alg調(diào)控纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Lac/LL@Alg處理組與纖維化模型組相比，共有634個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化。GO和KEGG分析顯示，免疫調(diào)節(jié)、代謝重編程、細(xì)胞骨架重塑相關(guān)通路顯著富集。GSEA分析顯示，IBD通路、ECM受體相互作用通路在纖維化模型中上調(diào)，而在Lac/LL@Alg組中下調(diào)。此外，AMPK和apelin信號(hào)通路顯著激活。免疫熒光證實(shí)，M1型巨噬細(xì)胞在克羅恩病患者狹窄組織中增多，而Lac/LL@Alg處理后M1減少，M2增多。

10、LL37通過AMPK介導(dǎo)的自噬發(fā)揮抗纖維化作用

在患者狹窄組織中，AMPK磷酸化水平顯著低于正常組織。體外實(shí)驗(yàn)中，LL37和Lac/LL@Alg均能激活A(yù)MPK，降低FN表達(dá)。使用AMPK激動(dòng)劑Metformin驗(yàn)證其抗纖維化作用，而AMPK抑制劑Compound C則顯著削弱LL37的效果，表明AMPK是LL37抗纖維化的關(guān)鍵通路。整合轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，自噬通路在纖維化中顯著抑制。臨床樣本中，自噬相關(guān)基因表達(dá)下降，LL37處理后LC3B-II/I比值上升，p62下降，mTOR磷酸化下降，表明自噬流恢復(fù)。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，LL37與apelin受體（APJ）具有強(qiáng)結(jié)合力，提示可能通過GPCR激活A(yù)MPK。

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