臨床常見致病細菌的分離培養(yǎng)

一、常用分離培養(yǎng)基及其選擇

1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

血瓊脂平板（BAP）： 最常用的非選擇性培養(yǎng)基。含有5%脫纖維羊血，適用于絕大多數(shù)需氧和兼性厭氧菌的生長，并可觀察溶血現(xiàn)象（α， β， γ溶血）。

2. 選擇性培養(yǎng)基：

巧克力色瓊脂： 含有V因子和X因子，專用于培養(yǎng)營養(yǎng)要求高的細菌，如嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬。

麥康凱瓊脂（MAC） / 伊紅美藍瓊脂（EMB）： 腸道桿菌弱選擇培養(yǎng)基，含有膽鹽和結(jié)晶紫，可抑制革蘭陽性菌生長。根據(jù)乳糖發(fā)酵能力鑒別腸道致病菌（菌落無色透明）與非致病菌（粉紅或紫黑色）。

SS瓊脂：腸道桿菌強選擇性培養(yǎng)基，用于分離沙門氏菌和志賀氏菌。淋病奈瑟菌培養(yǎng)基： 如MTM（改良Thayer-Martin）培養(yǎng)基。

堿性瓊脂或TCBS培養(yǎng)基：適用弧菌等。

血液增菌培養(yǎng)基：適用于血液、骨髓、無菌體液。

二、分離培養(yǎng)技術(shù)方法

為了從混雜的標本中獲得單個菌落，必須采用正確的劃線接種方法。

1. 分區(qū)劃線法： 最經(jīng)典的四區(qū)劃線法。通過無菌接種環(huán)在平板表面連續(xù)劃線，使細菌數(shù)量逐漸稀釋，最終在第四區(qū)或第三區(qū)形成獨立的單個菌落。

注：接種環(huán)灼燒滅菌要充分、每一區(qū)劃線需燒灼接種環(huán)、力度適中避免劃破瓊脂。

2. 斜面接種法：在培養(yǎng)基斜面自下而上劃曲線，適用于單菌落的轉(zhuǎn)種、純培養(yǎng)、生化反應等。

3. 液體接種法：液體培養(yǎng)基接種。

4. 穿刺接種法：半固體、明膠及雙糖管等培養(yǎng)基接種。

5. 傾注平板法：兼性厭氧菌或厭氧菌的稀釋定量培養(yǎng)，以及尿液、飲水等標本的菌落計數(shù)。

6.涂布接種法：將標本均勻涂布于培養(yǎng)基表面，常用于紙片法藥物敏感性試驗或菌落計數(shù)。

 注：尿液和肺泡灌洗液使用定量接種。

三、 培養(yǎng)環(huán)境與條件

根據(jù)不同細菌對氧氣的需求，應提供相應的氣體環(huán)境：

1. 需氧培養(yǎng)： 置于普通孵箱（35℃±2℃），適用于大多數(shù)常見致病菌（葡萄球菌、大腸埃希菌等）。通常培養(yǎng)18-24小時觀察初步結(jié)果，陰性標本需延長至48-72小時。

2. 二氧化碳培養(yǎng)： 置于5%-10% CO?孵箱或燭缸。適用于苛養(yǎng)菌如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌等。CO?可促進其生長。

3. 厭氧培養(yǎng)： 使用厭氧罐（產(chǎn)氣袋+指示劑）、厭氧培養(yǎng)箱或厭氧袋。需進行厭氧培養(yǎng)的標本包括深部膿腫、腹腔感染、壞死性筋膜炎等標本。厭氧菌培養(yǎng)周期較長，通常需48-72小時甚至更久。

四、 結(jié)果觀察與菌落判讀

1. 大小與形態(tài)： 點狀、針尖狀、中等、大菌落。

2. 顏色與色素： 金黃色（金葡菌）、綠色（銅綠假單胞菌）、灰白色等。

3. 溶血性： 完全透明的β溶血（如化膿性鏈球菌）、草綠色的α溶血（如肺炎鏈球菌）、不溶血的γ溶血（如腸球菌）。

4. 氣味： 特殊氣味具有提示意義，如銅綠假單胞菌的“果香味/玉米味”、厭氧菌的“腐敗味”。但不建議去聞原始平板。

5. 乳化性： 在生理鹽水中的乳化難易度，如肺炎鏈球菌易乳化，而其他鏈球菌不易乳化。

五、 純培養(yǎng)

在平板中發(fā)現(xiàn)可疑致病菌菌落后，需進行純培養(yǎng)：

挑取單個菌落，轉(zhuǎn)種至新鮮的血平板，獲得大量純種細菌，用于后續(xù)的生化鑒定、全自動微生物鑒定系統(tǒng)（如VITEK、MALDI-TOF MS）檢測、血清學凝集或藥敏試驗等。

如何分離被變形桿菌污染的金黃色葡萄球菌？

本人在進修學習期間，跟隨老師學習到一個方法，十分好用，分享如下：

先用95%酒精涂滿平板，在一區(qū)和二區(qū)交界處貼MEM紙片，在三區(qū)和四區(qū)交界處貼ATM紙片。

六、 質(zhì)量控制

1. 革蘭染色：每周或染色不符合時進行質(zhì)控，陽性用ATCC25923菌株，陰性用ATCC25922菌株。分享一個小方法：

分別用ATCC25923和ATCC25922菌株調(diào)成3 mcf菌懸液，涂在一張玻片上，每次取出一張片子使用，節(jié)約成本和時間。可以一次性制作三個月的片子。

2、培養(yǎng)基質(zhì)控：每批新培養(yǎng)基需進行無菌實驗、用標準菌株（如ATCC菌株）測試其生長能力，選擇性培養(yǎng)基進行抑菌實驗（比如SS金葡菌不生長）。

3、 環(huán)境監(jiān)測： 定期對生物安全柜、孵箱進行消毒和監(jiān)測，防止交叉污染。

4、 生物安全： 所有臨床標本均應視為具有潛在傳染性，必須在生物安全柜（BSC II級）內(nèi)進行操作。