為什么你的細(xì)胞一傳代就漂嗎？
一、胰酶消化過度（隱性細(xì)胞致死）
原因：
胰酶過度分解細(xì)胞表面黏附蛋白，細(xì)胞當(dāng)場不會破碎，但會徹底喪失貼壁能力，培養(yǎng)幾小時后大量漂浮死亡。
典型表現(xiàn)：
傳代完成時細(xì)胞形態(tài)完整、狀態(tài)無明顯異常，但是培養(yǎng)過夜后，細(xì)胞會呈現(xiàn)出整片漂浮、透亮虛化、無貼壁細(xì)胞。
解決辦法：
1、摒棄固定時間消化法，觀察鏡下狀態(tài)判斷：
常規(guī)貼壁細(xì)胞消化1分鐘后開始觀察，看到細(xì)胞皺縮變圓、間隙變大、輕晃瓶底有細(xì)胞松動，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，絕不硬卡3分鐘時長。
2、控制消化環(huán)境：
胰酶要提前拿出來，禁止使用4℃冷胰酶直接消化；加了胰酶的細(xì)胞要放37℃的培養(yǎng)箱消化，全程實時觀察，避免長時間放置。
3、定期更換胰酶：
胰酶反復(fù)開蓋、長期存放會導(dǎo)致活性不穩(wěn)定，建議小規(guī)格分裝，避光保存，建議每月更換新鮮胰酶，降低消化異常風(fēng)險。
二、PBS 漂洗不充分，間接引發(fā)細(xì)胞消化過度
原因：
舊培養(yǎng)基中的血清，會中和胰酶活性，殘留的培養(yǎng)基，會導(dǎo)致細(xì)胞局部消化不完全，操作人員為保證細(xì)胞充分脫落，通常會延長消化時間，進(jìn)而導(dǎo)致整瓶細(xì)胞消化過度、細(xì)胞膜受損。
典型表現(xiàn)：
細(xì)胞脫落程度不均，部分細(xì)胞難以吹打脫落，部分細(xì)胞提前脫落；傳代后細(xì)胞大小不一，后續(xù)出現(xiàn)大量細(xì)胞漂浮、死亡。
解決辦法：
1、吸凈舊培養(yǎng)基后，須用無菌PBS輕柔漂洗1次，完全覆蓋瓶底后輕輕晃動，徹底沖掉殘留的血清與死細(xì)胞，再吸凈PBS，無殘留液體。
2、傳代操作中切勿省略 PBS 漂洗步驟。
三、吹打操作暴力，細(xì)胞隱性損傷
原因：
快速、反復(fù)、大力吹打會產(chǎn)生大量氣泡，氣泡剪切力會撕裂細(xì)胞膜、破壞細(xì)胞骨架，造成細(xì)胞隱性損傷并喪失貼壁增殖的能力，后續(xù)會逐漸懸浮死亡。
典型表現(xiàn)：
傳代后1-6小時開始陸續(xù)漂細(xì)胞，細(xì)胞碎片多、狀態(tài)雜亂。
解決辦法：
1、規(guī)范吹打手法：
采用慢速、輕柔、無氣泡吹打方式，槍頭貼瓶壁緩慢出液，避免直沖細(xì)胞沉淀。
2、控制吹打次數(shù)：
每次傳代吹打5-8次即可，混勻細(xì)胞，禁止反復(fù)無休止吹打。優(yōu)先使用1mL槍頭吹打，避免使用5mL大槍頭，因力度過大而損傷細(xì)胞。
四、接種密度不當(dāng)（過稀凋亡/過密老化）
原因：
多數(shù)貼壁細(xì)胞存在密度依賴性生長，密度過低無法分泌生長因子，細(xì)胞自發(fā)凋亡；密度過高則細(xì)胞堆疊老化、營養(yǎng)匱乏，傳代后會批量死亡。
典型表現(xiàn)：
過稀：接種細(xì)胞零星分散，次日全部漂浮，無存活貼壁細(xì)胞；
過密：細(xì)胞長滿100%堆疊后傳代，細(xì)胞形態(tài)會干癟、破碎，存活率極低。
解決辦法：
1、嚴(yán)格把控傳代時機(jī)：
細(xì)胞匯合度80%-90%為最佳傳代狀態(tài)，禁止長滿100%堆疊后再傳代。
2、新手統(tǒng)一安全傳代比例：
常規(guī)細(xì)胞默認(rèn)1:2傳代，絕不1:3、1:4及以上超稀疏傳代。
小眾難養(yǎng)的細(xì)胞、脆弱的細(xì)胞，則需要采用1:1的比例傳代，以保證細(xì)胞的密度。
五、細(xì)胞帶毒/狀態(tài)差（復(fù)蘇后遺癥）
原因：
剛復(fù)蘇的細(xì)胞會有殘留的DMSO毒性、存在大量隱性受損細(xì)胞，若細(xì)胞尚未恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)就進(jìn)行傳代，會引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激，出現(xiàn)大批量漂浮、死亡。
典型表現(xiàn)：
細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁率低，存活細(xì)胞長滿后傳代正常。
解決辦法：
嚴(yán)格遵守復(fù)蘇流程：
1、細(xì)胞復(fù)蘇24小時后必須換液，徹底清除殘留DMSO和死細(xì)胞。
2、禁止復(fù)蘇當(dāng)天、復(fù)蘇24小時內(nèi)傳代，等待細(xì)胞完全貼壁、狀態(tài)穩(wěn)定后再操作。
六、隱性污染（支原體/微量細(xì)菌）
原因：
輕度支原體污染大多無肉眼可見渾濁、無明顯絮狀物，短期內(nèi)不會造成細(xì)胞徹底報廢，但會持續(xù)損傷細(xì)胞活性，導(dǎo)致每次傳代必漂、生長緩慢、形態(tài)畸形。
典型表現(xiàn)：
連續(xù)2次及以上傳代出現(xiàn)大量細(xì)胞漂浮，細(xì)胞黑點多、形態(tài)不規(guī)則、增殖速度大幅變慢。
解決辦法：
1、做支原體檢測，確認(rèn)污染后直接丟棄污染細(xì)胞，切勿繼續(xù)傳代挽救。
2、徹底消殺超凈臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋，更換全新培養(yǎng)基、血清，避免交叉污染。
3、新復(fù)蘇細(xì)胞全程無菌規(guī)范操作，杜絕污染源。
七、血清/培養(yǎng)基的問題
原因：
培養(yǎng)基配比錯誤、血清變質(zhì)、血清濃度不夠、批次差異，會直接導(dǎo)致細(xì)胞貼壁能力下降，傳代后大量漂浮死亡，未觀察到明顯污染，操作流程亦無異常，但細(xì)胞仍持續(xù)出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象。
典型表現(xiàn)：
操作流程完全標(biāo)準(zhǔn)、消化/吹打/密度全部正常，細(xì)胞依然一傳代就漂；細(xì)胞貼壁松散、形態(tài)干癟、伸展緩慢，生長速度持續(xù)偏慢。
解決辦法：
1. 嚴(yán)格把控血清濃度：
常規(guī)腫瘤細(xì)胞、普通貼壁細(xì)胞統(tǒng)一使用10%胎牛血清；脆弱細(xì)胞、原代細(xì)胞、難貼壁細(xì)胞需提升至12%-15%血清，嚴(yán)禁私自降至5%-8%低濃度，血清不足會直接導(dǎo)致粘附蛋白缺失、貼壁失敗。
2. 杜絕血清反復(fù)凍融：
原裝血清到貨后，按需分裝為50mL/100mL的小規(guī)格裝，-20℃避光保存，每次只用一管，禁止反復(fù)凍融；反復(fù)凍融會破壞血清生長因子、粘附蛋白，大幅降低細(xì)胞貼壁能力。
3. 禁止使用過期血清：
嚴(yán)禁使用過期、開封超過1個月、渾濁、輕微沉淀的血清。
4. 培養(yǎng)基規(guī)范使用：
完全培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，盡量1周內(nèi)用完，最長不超過2周；放置過久的培養(yǎng)基會營養(yǎng)流失、pH失衡，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激、貼壁脫落；禁止使用偏酸、偏堿、有輕微沉淀的老舊培養(yǎng)基。
5. 排查血清批次適配性：
部分細(xì)胞對血清批次敏感，更換新批次血清后出現(xiàn)持續(xù)漂細(xì)胞，大概率是血清批次不適配，需更換適配的批次血清。
