流式為什么一定要排除死細胞？

死細胞如何擾亂流式結果？

死細胞對流式結果的影響，主要來自它的兩個特點：膜破了，但抗原還在；保安沒了，什么染料都能亂鉆。

首先，細胞死亡后，雖然膜的完整性喪失了，但表面抗原不會立刻消失。它們仍然能結合抗體，但又不像活細胞那樣保持穩態。這就導致第一個問題：我們測到的陽性信號，到底來自真的陽性細胞，還是死細胞上殘留的抗原？

其次是第二個問題。膜破損后，死細胞內部暴露，各種熒光染料可以自由進入，非特異性地結合到細胞內各種分子上，這可就不是膜上那一點點了。這就導致死細胞的熒光背景會異常升高，而且沒有特異性——它可能在所有通道里都發出信號，因為它什么染料都可能結合一下，在散點圖上常常表現為沿對角線分布的斜線信號。

這會造成幾個后果：假陽性率升高、細胞分群模糊、如果存在弱陽性群體還會被淹沒在高背景里。這里有個很直觀的例子：外周血樣本中如果不排除死細胞，CD4 和 CD8 的散點圖上會出現一團詭異的共陽性細胞群，雖然可能是DP細胞，但正常情況下表達很少，肯定不能是圖上這樣；而死細胞排除后，正常的互斥分布就恢復了。

如何排除死細胞？

FSC/SSC光散射法

這是最簡單快捷的方法。不需要染料專門標記，只要在圈門的時候稍微區分一下就可以分離大部分死細胞。原理很簡單：活細胞、死細胞和細胞碎片，在光散射特性上有差異。

由于前向角散射（FSC）大致反映細胞大小，側向角散射（SSC）反映細胞內部顆粒度。而死細胞通常會皺縮（FSC 變小）、內部結構紊亂（SSC 變大），因此在 FSC/SSC 圖上，它們往往出現在活細胞群的左上方或左外側——比活細胞小，但比碎片大，而且比活細胞混亂。

但這個方法有個局限：它區分的細胞形態上明顯異常。如果細胞剛死，形態變化不明顯，還沒來得及皺縮等情況，光靠 FSC/SSC 不夠。所以更多實驗還要用死活染料進一步確認活細胞群。

死活染料法

更精確的方法是使用死活染料。原理都基于膜完整性，但有兩類：

●核酸染料（如 PI、7-AAD、DAPI）：不能透過活細胞膜，只能進入死細胞結合核酸發出熒光。優點是方便，染色后直接上機，但不能洗，也不能固定，因為固定需要對所有細胞進行破膜，活細胞也會染上。

●胺活性染料：這類染料是與蛋白質伯氨基共價結合。活細胞只染上表面蛋白，熒光弱；死細胞染料進入內部，結合大量胞內蛋白，熒光強。最大的優點是染色后可固定、可破膜，適用于胞內染色實驗。

哪些情況建議做死活染色？

這個問題可以理解為：樣本狀態會帶來多少死細胞的影響，以及實驗對準確度的需求有多高。

●從樣本狀態看：新鮮外周血、脾臟等樣本，如果處理得當，死細胞比例低，單靠 FSC/SSC 通常夠用。但如果是腫瘤組織、難制備的組織、凍存復蘇后的細胞，死細胞和碎片會很多，必須用死活染料精確排除。

●從實驗需求看：多色流式實驗、弱表達抗原檢測、胞內染色實驗，都強烈建議做死活染色。道理很簡單：顏色越多，背景越復雜；抗原越弱，越容易被死細胞的非特異性信號淹沒。

反之，如果只是普通地測一下新鮮外周血的 CD3/CD4/CD8 等強表達指標，FSC/SSC 圈門通常就夠了。但前提是樣本狀態確實好，死細胞少，活細胞健康，對實驗精度沒有很高的要求。

總的來說，排除死細胞是根據樣本和實驗精度決定如何做的必須步驟。