6種病理實驗染色方法教學(xué)&總結(jié)！
病理染色是組織形態(tài)學(xué)觀察、疾病機制研究、病理診斷的核心技術(shù)，不同染色方法對應(yīng)不同觀察目標(biāo)，操作規(guī)范直接影響結(jié)果可靠性。本文整理科研中高頻使用的 6 種病理染色方法，從原理、試劑、步驟到結(jié)果判讀，一站式清晰呈現(xiàn)，方便實驗參考與復(fù)盤。
一、HE 染色
HE 染色是石蠟切片最基礎(chǔ)、應(yīng)用最廣泛的染色方法，適用于各類動物組織，可清晰呈現(xiàn)組織基本形態(tài)與病理改變，是病理實驗的入門必學(xué)。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、伊紅染液、中性樹膠封片劑。
實驗步驟
脫蠟與水化
石蠟切片在 59-62℃條件下烤片 1 小時。依次用二甲苯脫蠟 3 次，每次 10 分鐘。再用無水乙醇處理 3 次，80% 乙醇處理 1 次，每次洗滌 2 分鐘。最后用蒸餾水洗滌至切片完全水化。
染核
將玻片放入蘇木素染液中染色 5-15 分鐘，時間根據(jù)染液濃度與切片厚度調(diào)整。用自來水沖洗去除多余染液，鏡檢確認(rèn)細(xì)胞核著色情況。
分化
把染色后的玻片放入分化液中處理數(shù)秒，立即用自來水沖洗終止分化，鏡下調(diào)整細(xì)胞核染色深淺。
返藍(lán)
將玻片置于返藍(lán)液浸泡 2 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘。
伊紅染色
玻片放入伊紅染液中染色 5 秒至 5 分鐘，按實驗需求調(diào)整時間。用純水浸洗 6 次，每次輕涮兩下，快速吹干防止水漬殘留。
封片
滴加 1-2 滴中性樹膠，平緩蓋片，避免產(chǎn)生氣泡。
染色結(jié)果
細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈亮紅色，對比鮮明，便于形態(tài)觀察與分析。
二、IHC 免疫組化
免疫組化依托抗原抗體特異性結(jié)合原理，可精準(zhǔn)定位組織內(nèi)目標(biāo)抗原，是蛋白定位、定量、定性分析的關(guān)鍵技術(shù)，廣泛用于基礎(chǔ)科研與臨床病理檢測。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、檸檬酸鈉或 EDTA 抗原修復(fù)液、3% 過氧化氫、封閉液、一抗、二抗、DAB 顯色液、Mayer 蘇木素、返藍(lán)液、中性樹膠封片劑。
實驗步驟
脫蠟與水化
操作流程與 HE 染色一致，確保切片充分脫蠟水化。
滅活
用 3% 過氧化氫浸泡 15 分鐘，蒸餾水洗滌干凈。
抗原修復(fù)
提前預(yù)熱抗原修復(fù)液，將玻片放入修復(fù)液，采用微波修復(fù) 15 分鐘兩次，或高溫高壓修復(fù) 2 分 30 秒。修復(fù)后放入冷水降溫，純水涮洗 3 次，1×PBS 或 PBST 洗滌 1 次。
封閉
滴加 5% BSA 封閉液，室溫放置 35 分鐘，全程保持切片濕潤，避免干片。
一抗孵育
甩去多余液體，不洗滌直接滴加一抗，4℃過夜孵育。次日取出復(fù)溫 15 分鐘，純水涮洗 4 次，1×PBS 或 PBST 洗滌 1 次。
二抗孵育
擦去多余液體，滴加二抗室溫孵育 1 小時，后續(xù)洗滌步驟同一抗。
DAB 顯色
現(xiàn)配 DAB 顯色液，滴加在玻片上，鏡下監(jiān)控顯色進(jìn)程，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。
復(fù)染與返藍(lán)
蘇木素復(fù)染 2-5 分鐘，蒸餾水洗滌。再用返藍(lán)液浸染 1 分鐘，蒸餾水洗滌后鏡檢。
脫水封片
依次用無水乙醇脫水，熱風(fēng)吹干，中性樹膠封片，完成后可掃描保存。
染色結(jié)果
陽性表達(dá)呈棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。
三、MASSON 染色
MASSON 染色依據(jù)染料分子量差異與組織滲透性不同，可清晰區(qū)分膠原纖維與肌纖維，常用于纖維化、組織損傷修復(fù)相關(guān)研究。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、重鉻酸鉀、蘇木素、復(fù)紅染液、磷鉬酸、苯胺藍(lán)、冰醋酸、中性樹膠封片劑。
實驗步驟
切片處理
石蠟切片按標(biāo)準(zhǔn)流程完成脫蠟與水化。冰凍切片需從 - 20℃取出復(fù)溫，固定液固定 20 分鐘，水洗后進(jìn)入染色步驟。
重鉻酸鉀媒染
滴加重鉻酸鉀溶液，37℃烤箱放置 3-4 小時，自來水洗凈。
蘇木素染色
石蠟切片浸染 5 分鐘，冰凍切片浸染 2 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘，純水浸洗 2 次。
復(fù)紅染色
滴加復(fù)紅染液，室溫染色 5 分鐘。
磷鉬酸處理
甩去多余染液，滴加磷鉬酸染液，石蠟切片處理 30 秒，冰凍切片處理 10 秒。
苯胺藍(lán)染色
滴加苯胺藍(lán)染液，時間根據(jù)樣本類型調(diào)整。
冰醋酸洗滌
用稀釋后的冰醋酸充分洗滌切片。
脫水封片
無水乙醇快速脫水，吹干后中性樹膠封片，鏡檢觀察。
染色結(jié)果
肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍(lán)色。
四、PAS 染色
PAS 染色即糖原染色，是病理常規(guī)染色方法，可清晰顯示糖原、多糖、中性黏液物質(zhì)、基底膜、真菌等結(jié)構(gòu)，適用范圍廣泛。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、過碘酸、Schiff 染色液、蘇木素染色液。
實驗步驟
脫蠟與水化
按照石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)流程完成脫蠟水化處理。
過碘酸氧化
玻片置于氧化劑中，室溫避光放置 5-8 分鐘，不超過 10 分鐘。自來水沖洗 1 次，純水浸洗 2 次，每次 2 分鐘。
Schiff 試劑染色
將玻片放入 Schiff 染液，室溫避光浸染 5-20 分鐘，自來水沖洗 10 分鐘。
復(fù)染與返藍(lán)
Mayer 蘇木素復(fù)染細(xì)胞核 1-2 分鐘，自來水沖洗 10 分鐘。繼續(xù)用自來水沖洗 10-15 分鐘返藍(lán)，純水浸洗 2 次。
脫水封片
梯度無水乙醇脫水，熱風(fēng)吹干，中性樹膠封片。
染色結(jié)果
PAS 陽性物質(zhì)呈紅色或紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈深淺不一的紅色。
五、TUNEL 染色（顯色法）
TUNEL 染色用于檢測細(xì)胞凋亡，通過標(biāo)記 DNA 斷裂末端，在光學(xué)顯微鏡下直觀識別凋亡細(xì)胞，是細(xì)胞凋亡研究的經(jīng)典方法。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、蛋白酶 K、3% 過氧化氫、PBS 緩沖液、TdT 酶、Biotin-dUTP、Streptavidin-HRP、標(biāo)記反應(yīng)終止液、DAB 顯色液、中性樹膠封片劑。
實驗步驟
脫蠟與水化
石蠟切片完成標(biāo)準(zhǔn)脫蠟水化流程。
蛋白酶 K 處理
滴加 20μg/ml 無 DNase 的蛋白酶 K，37℃作用 15-30 分鐘，PBS 洗滌 3 次，每次 15 分鐘，確保洗凈蛋白酶 K。
封閉內(nèi)源性過氧化物酶
3% 過氧化氫室溫孵育 15-20 分鐘，PBS 洗滌 4 次，每次 10 分鐘，避免孵育過久導(dǎo)致假陽性。
生物素標(biāo)記
滴加生物素標(biāo)記液，37℃避光孵育 60 分鐘，PBS 洗滌 1 次。
終止反應(yīng)
滴加標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育 10 分鐘，PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘。
Streptavidin-HRP 孵育
滴加工作液室溫孵育 30 分鐘，PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘。
DAB 顯色
現(xiàn)配顯色液，室溫孵育 5-30 分鐘，蒸餾水沖洗終止。
復(fù)染返藍(lán)、脫水封片
蘇木素復(fù)染、返藍(lán)液處理后梯度脫水，中性樹膠封片，可掃描存檔。
染色結(jié)果
凋亡細(xì)胞呈棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。
六、天狼猩紅染色
天狼猩紅染色可特異性結(jié)合膠原纖維，配合偏振光顯微鏡能區(qū)分不同類型膠原，是膠原纖維分型、纖維化程度評估的常用方法。
實驗試劑
二甲苯、無水乙醇、蒸餾水、天狼猩紅染色液、中性樹膠封片劑。
實驗步驟
脫蠟與水化
厚度 6μm 的石蠟切片，59-62℃烤片 1 小時，按標(biāo)準(zhǔn)流程脫蠟水化。
染色
滴加天狼猩紅染色液，染色 0.5-1 小時，背景過深可縮短時間或稀釋染液。流水輕沖去除表面多余染液。
脫水封片
無水乙醇快速脫水，吹干防止水漬，中性樹膠封片。
染色結(jié)果
膠原纖維呈紅色，背景清晰，偏振光下可區(qū)分不同膠原類型。
實驗總結(jié)與注意事項
6 種染色均以石蠟切片脫蠟水化為基礎(chǔ)，此步驟不徹底會導(dǎo)致染色不均、背景過深，需嚴(yán)格控制時間與試劑濃度。
顯色類實驗需現(xiàn)配現(xiàn)用試劑，避免反復(fù)凍融影響活性，孵育過程避光、控溫，減少假陽性與非特異性著色。
脫水、封片環(huán)節(jié)要快速操作，防止水漬與氣泡，保證切片長期保存與清晰觀察。
不同組織、切片厚度需微調(diào)染色時間，正式實驗前建議做預(yù)實驗，確定最優(yōu)條件。
病理染色看似步驟固定，實則細(xì)節(jié)決定成敗。熟練掌握這 6 種常用方法，能大幅提升病理實驗效率與結(jié)果可靠性，為后續(xù)科研分析打下堅實基礎(chǔ)。
