細胞傳代，你真的會嗎？這幾個細節決定細胞狀態

傳代，細胞培養里最日常的操作。

消化、終止、吹打、分瓶，一套流程下來，十分鐘搞定。做了幾百次，閉著眼睛都能做。

但你可能沒想過：為什么有時候傳代后細胞長得快，有時候長得慢？為什么同樣的細胞，狀態時好時壞？

問題可能就出在傳代這個“閉著眼睛都能做”的操作上。

一、消化時間，長一點短一點差別很大

胰酶消化，是傳代最關鍵的步驟。時間短了，細胞不下來；時間長了，細胞膜受損。

很多人消化的時候，把培養瓶往培養箱里一放，轉頭去干別的事，等想起來的時候已經過了好幾分鐘。這樣做最傷細胞。

胰酶的作用是切斷細胞和培養皿之間的黏附蛋白。消化時間過長，細胞膜上的其他蛋白也會被切斷，細胞表面的受體、通道蛋白都會受損。雖然細胞還能貼壁，但狀態已經打了折扣。

正確做法是：加入胰酶后，放在顯微鏡下觀察。看到細胞變圓、邊緣開始收縮、有少量細胞脫落的時候，立刻終止。不同細胞消化時間不一樣，HeLa可能一兩分鐘就夠了，原代成纖維細胞可能需要五分鐘。觀察比計時更靠譜。

終止消化的時候，用含血清的培養基，血清量要足夠。胰酶和血清的比例至少1:1，才能充分中和。加進去之后輕輕搖晃，讓胰酶和血清充分接觸，不要直接吹打。

二、吹打，溫柔一點

消化后的細胞是脆弱的。沒有貼壁保護，細胞膜直接暴露在環境中。

很多人吹打的時候很猛，把移液管插到管底，使勁來回吸打，恨不得把細胞團全部打散。這樣做會把細胞膜吹破，活細胞率直線下降。

正確做法是：用血清或培養基預先潤洗移液管，減少細胞粘壁。吹打的時候，移液管口靠在管壁或管底，輕輕吸打。不要產生氣泡，氣泡破裂時的剪切力也會損傷細胞。

吹打的次數也不是越多越好。能吹散就行，不要追求“完全單細胞”。少量小團塊對后續培養沒有太大影響，但過度吹打對細胞的損傷是實打實的。

三、傳代比例，不是固定的

很多實驗室習慣“1:3傳代，三天長滿”。這個比例對特定細胞、特定培養瓶來說可能合適，但不是所有細胞都適用。

傳代比例的核心是：細胞接種后的密度要合適。太稀了，細胞長得慢，甚至不長；太密了，很快接觸抑制，細胞形態變差，還容易老化。

不同細胞的生長速度不一樣。293T可能一天就長滿了，原代神經元可能需要一周。同一個細胞，不同代次、不同狀態，生長速度也不一樣。

正確做法是：根據細胞的生長速度靈活調整。如果你發現傳代后三天才長到50%，下次就降低傳代比例，比如1:2；如果兩天就長滿了，就提高比例，比如1:4或1:6。

經驗是靠積累的。每次傳代的時候記錄一下：傳代比例、接種密度、多久長滿。幾次之后，你就知道這個細胞的最佳傳代比例是多少了。

四、培養液，別省

傳代的時候，很多人習慣“省著用”。一瓶細胞，加2毫升胰酶消化，加2毫升培養基終止，再補到5毫升，分到兩個瓶子里，每瓶再加3毫升培養基。

這樣做的問題在于：消化和終止的時候，培養液總量太少。細胞在胰酶和血清濃度不穩定的環境中待太久，容易應激。

正確做法是：消化后用足夠的培養基終止（比如5毫升），離心收集細胞，用新鮮培養基重懸。雖然多了一步離心，但細胞狀態更穩定。

如果不離心，直接分瓶，也要保證分瓶后每瓶的總體積足夠。T25瓶至少5毫升，T75瓶至少10毫升。培養基太少，細胞營養不夠，pH變化太快，狀態不會好。

五、貼壁時間，給夠

分瓶之后，細胞需要時間貼壁。這個過程通常需要幾個小時。

很多人分瓶后馬上把培養瓶拿起來看，或者搬到顯微鏡下觀察，頻繁晃動。這樣會干擾細胞貼壁，尤其是剛傳代的前一兩個小時。

正確做法是：分瓶后輕輕搖晃幾下，讓細胞分布均勻，然后放回培養箱，至少4小時內不要動它。第二天再觀察貼壁情況和形態。

如果細胞貼壁率一直很低，可以試試用膠原包被的培養瓶，或者提高接種密度。貼壁不好，很多時候不是細胞的問題，是培養條件的問題。

傳代這件事，看起來簡單，做起來全是細節。

消化要看著做，不要憑感覺；吹打要溫柔，不要暴力；比例要靈活，不要死板；貼壁要給時間，不要著急。

這些細節不會出現在任何實驗記錄本里，但它們決定了你的細胞是“健康地長”還是“湊合著活”。

下次傳代的時候，不妨慢下來，多觀察一下。細胞的狀態，就藏在這些細節里。