微生物實驗室質(zhì)控菌株復蘇、保存與管理常見問答

第一部分：基礎(chǔ)概念

A: 質(zhì)控菌株（Quality Control Strains）是特性明確、標準化的微生物菌株，用于驗證培養(yǎng)基、試劑、儀器和檢測方法的性能是否符合預期標準。

重要性體現(xiàn)在：

保證準確性：確保實驗結(jié)果準確可靠。

進行溯源：為實驗結(jié)果提供可比性和溯源性。

故障排查：當實驗出現(xiàn)問題時，用于判斷是樣本問題還是系統(tǒng)（如培養(yǎng)基、試劑）問題。

A: 通常主要有兩種形式：

1、凍干粉（Lyophilized Powder或Freeze-Dried）：密封于安瓿瓶中，處于休眠狀態(tài)，穩(wěn)定性最好，保存期長。這是最常見的形式。

2、冷凍保存物（Frozen Culture）：保存于液氮或-80°C超低溫冰箱中，通常置于菌種保存管（如瓷珠管）內(nèi)。

A: 傳代是指將微生物從舊的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，以獲得新鮮、活躍生長的培養(yǎng)物的過程。過度傳代會增加菌株變異（如毒力、生化特性改變）的風險。

第二部分：復蘇（Revival）

A: 標準操作步驟如下（請務必在生物安全柜中進行，并遵守個人防護原則）：

1、準備：準備好合適的液體培養(yǎng)基（如TSB）、平板（如TSA）、無菌吸管、酒精燈、安瓿瓶開瓶器等。

2、消毒與開瓶：用酒精棉球徹底擦拭安瓿瓶頂部，待干。用砂輪在頸部劃一圈痕，或用專用開瓶器直接掰開。注意避免產(chǎn)生氣溶膠。

3、復水：用無菌吸管吸取約0.5-1mL的液體培養(yǎng)基，滴加至安瓿瓶內(nèi)，輕輕吹吸或晃動，使凍干粉充分溶解，形成菌懸液。

4、轉(zhuǎn)移與培養(yǎng)：將全部菌懸液吸取并轉(zhuǎn)移至裝有5-6mL液體培養(yǎng)基的試管中，或直接劃線接種至平板。在合適的溫度（通常為35±2°C）下培養(yǎng)18-24小時（或根據(jù)證書建議的時間）。

5、確認：觀察生長情況，檢查菌落形態(tài)、純度，必要時進行染色鏡檢或生化鑒定確認。

A: 通常不建議。凍干粉復蘇后菌株可能處于應激狀態(tài)，活性較弱。建議復蘇后傳代一次，使用第二代（F2）或第三代（F3） 的培養(yǎng)物進行質(zhì)控實驗，以確保菌株的活力和穩(wěn)定性。具體使用哪一代應遵循菌株說明書或?qū)嶒炇襍OP的規(guī)定。

A:操作問題：復水不充分；復蘇培養(yǎng)基不合適；培養(yǎng)條件（溫度、氣氛）錯誤。

菌株本身問題：保存時間過長，已死亡；運輸過程中受過熱等不當處理。

污染：操作過程中引入污染。

第三部分：保存（Preservation）

A:短期保存（1-4周）：

平板保存：封口膜封好，正置于2-8°C冰箱。適用于頻繁使用的菌株，但易變異和污染。

半固體瓊脂穿刺保存：用接種針穿刺接種于半固體培養(yǎng)基，生長后覆蓋無菌石蠟油，可延長保存時間至數(shù)月。

長期保存（數(shù)月到數(shù)年）：

瓷珠保存系統(tǒng)：商品化的菌種保存管，內(nèi)含瓷珠和保存液。將新鮮菌落刮入保存液中，吸走多余液體，-20°C或-80°C冷凍。取用時，用無菌鑷子取一顆瓷珠在平板上滾動即可。這是最推薦的家用方法。

甘油管保存：將菌懸液與無菌甘油混合（終濃度15%-30%），置于-80°C超低溫冰箱。可保存數(shù)年。

A:使用新鮮培養(yǎng)物：最好使用處于對數(shù)生長期的新鮮培養(yǎng)物進行保存。

標注清晰：保存管上必須清晰標注：菌株編號、名稱、保存日期、操作人。

避免反復凍融：特別是甘油菌種，反復凍融會大幅降低存活率。建議分裝成小份保存。

定期驗證：應定期（如每年）從保存庫中取出一管復蘇，檢查其存活率、純度和關(guān)鍵特性。

第四部分：管理與使用

A:代次：從原始來源（ATCC, NCTC等）接收到的菌株為第0代（F0）。每次傳代或復蘇后，代次增加1。

記錄原因：過度傳代會導致菌株遺傳漂變，特性發(fā)生改變（如抗生素敏感性下降、生化反應減弱）。記錄代次可以確保使用的菌株在一個可控的傳代范圍內(nèi)（通常建議不超過5-10代），保證其作為質(zhì)控菌株的可靠性和溯源性。

A: 清單應至少包含以下信息：

唯一內(nèi)部編號

菌種標準命名（如 Staphylococcus aureus ATCC 25923）

來源（購買證書號）

接收日期

保存位置（冰箱編號、盒子編號）

保存形式（瓷珠管、甘油管等）

當前代次（F0, F1, F2...）

保存日期

有效期/下次驗證日期

A: 立即停止使用！

1、對該菌株進行分離純化，嘗試獲得純培養(yǎng)。

2、對純化后的菌株進行全套鑒定（形態(tài)、染色、生化等），與標準特性對比。

3、如果無法恢復或確認，必須棄用，并從原始來源或認可的菌種保藏中心重新購買新菌株。

4、調(diào)查污染或變異的原因，審查操作流程，防止再次發(fā)生。

第五部分：安全與合規(guī)

A:生物安全等級（BSL）：明確所操作菌株的生物安全等級（BSL-1, BSL-2等），并在相應級別的實驗室和設(shè)備（如生物安全柜）中進行操作。

個人防護裝備（PPE）：必須穿著白大褂、戴手套，必要時佩戴護目鏡和口罩。

消毒滅菌：所有接觸過菌株的器材必須經(jīng)過高壓滅菌等有效方式處理后才能清洗或丟棄。

A: 所有活的菌株培養(yǎng)物、平板、試管等都必須經(jīng)過高壓滅菌（121°C, 30分鐘） 徹底滅活后，才能作為普通垃圾丟棄或進行清洗。

質(zhì)控菌株的管理是實驗室質(zhì)量保證的基石。遵循“規(guī)范操作、詳細記錄、定期驗證、安全第一”的原則，能確保您的質(zhì)控結(jié)果準確可靠，為整個檢測系統(tǒng)的有效性提供堅實支撐。