病毒包裝

Part.01

原理和過程

所謂病毒包裝，其核心是圍繞如何高效、特異地將外源基因導入特定的靶細胞中，最終使病毒載體能夠攜帶特定的外源目的基因，也就是將其包裝成病毒顆粒后，通過侵染宿主細胞，使外源基因導入到細胞內。

為了達到這個目的，同等還有其他常見手段如化學轉染（鈣轉、脂質體）和物理轉染（電穿孔、顯微注射等），在這些方法中，病毒包裝的優(yōu)勢針對于用戶追求長期、穩(wěn)定表達，且用于難轉染細胞或體內實驗。

病毒包裝實際是利用細胞的生物合成機器，在體外（細胞培養(yǎng)體系中）模擬病毒的自然復制過程，從而生產出有感染能力的重組病毒顆粒。整個過程如上圖，主要包括質粒構建、細胞轉染、病毒生產與組裝、病毒收集與純化、滴度測定。

病毒包裝在實際中用戶始終關注兩個點，即安全性和效率性，在這兩者平衡下，AAV（腺相關病毒）和LV（慢病毒）在眾多病毒選擇中脫穎而出。

Part.02

多質粒轉染有什么講究

多質粒系統(tǒng)指的是將病毒復制和包裝所需的全部遺傳元件，拆分到多個獨立的質粒上，然后通過共同轉染到包裝細胞中，讓這些元件在細胞內“分工合作”，最終生產出重組病毒顆粒。如慢病毒的三質粒系統(tǒng)，包裝質粒、包膜質粒和轉移質粒，那么這樣做的原因又是什么？是不是越多越好呢？

這個還是結合了安全性和效率出發(fā)的，其一，拆分是為了保證過程的安全性。通過拆分，確保沒有任何一個質?？梢元毩a生可復制的野生型病毒，只有在所有質粒共存的細胞里，才能生產出一次性的、無復制能力的病毒。

其二，將功能拆分開，可以減少單個質粒的大小，從而提高轉染效率。同時，可以精細調控不同元件的比例，優(yōu)化病毒產量。

最后是可以像搭積木一樣，輕松更換不同的元件（尤其是決定病毒靶向性的包膜/衣殼蛋白），來定制不同需求的病毒。

當前慢病毒中最經典的依舊是三質粒系統(tǒng)，而在臨床應用中為了更加注重安全，四質粒系統(tǒng)將包裝功能做了進一步拆分，將同源重組風險降至最低。

Part.03

滴度檢測有哪些手段

在整個包裝工藝中，病毒的純化和收集是至關重要的。病毒滴度是指單位體積（通常為毫升）液體中具有生物活性的病毒顆粒數，是評估病毒毒性和感染力的重要指標，換言之，其滴度越高，感染能力就越強。

但是，收獲的病毒中可能有些沒有感染能力，為了更加綜合監(jiān)測，主流結合物理滴度和感染滴度評估，這些數值也是眾多服務商交付時的重要指標。

物理滴度有兩種方式，一個是指包含病毒基因組的病毒顆粒的濃度，通過QPCR對病毒顆粒的基因組拷貝數進行檢測（也有叫作基因組滴度），這種靈敏度高，適用性廣，可是弊端在于會檢測到無功能的、破碎的、空的病毒顆粒，導致滴度被高估。結果通常比感染性滴度高1-3個數量級，受DNA酶/RNA酶污染影響。

另外快速便捷的手段則采取Elisa的方式，測定病毒衣殼/包膜上的蛋白含量。此種對應也有受限的問題，只能反映總蛋白量，與病毒顆粒數和感染性關聯度最差，無法區(qū)分完整病毒顆粒和游離的蛋白。

為了精準的獲得確切信息，行業(yè)內研究人員普遍會用細胞流式儀來獲得感染滴度的信息，即用系列稀釋的病毒（攜帶熒光報告基因，如GFP）感染細胞，48-72小時后，通過流式細胞儀檢測表達熒光蛋白的細胞比例，計算滴度。這個方式具有通量高、精度高的優(yōu)點，但設備成本高昂。

總而言之，一般的科研用戶在乎的是快和相對準確，而藥企中（臨床）必須全面考慮，快、穩(wěn)且合規(guī)。在國家法規(guī)中明確提出，應考慮采用流式檢測、ELISA及 qPCR 等多方法進行病毒滴度檢測，并積極探尋不同檢測方法間檢測數值的相關性。

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