Annexin V熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒實驗操作指南
Procell自主研發的熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒用于鑒定凋亡和壞死細胞。
Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸PS 有高度親和力，可通過細胞外側暴露的PS 與凋亡早期細胞胞膜結合，將Annexin V 標記上熒光染料利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡。
由于凋亡晚期或壞死細胞膜完整性喪失，細胞核染色液可進入細胞內染色細胞核，搭配Annexin V 使用可將處于不同凋亡時期的細胞區分開。
1．懸浮細胞：
A．按照實驗方案進行凋亡誘導，300g離心5min，棄上清，收集細胞，用PBS洗滌細胞一次，輕輕重懸浮細胞并計數。
B． 取1-5 × 105重懸的細胞，300g離心5min，棄上清。加入500μL稀釋成1 ×的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。
C． 細胞懸液中加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。
D．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15-20min。
E． 反應完成后立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內完成檢測。
F． 檢測
1） 流式細胞儀檢測
處理好的樣本在流式細胞儀上檢測。
2） 熒光顯微鏡分析
取一滴用熒光素-Annexin V/細胞核染色液雙染的細胞懸液（E步驟處理過的細胞懸液）于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。
2． 貼壁細胞
1）流式細胞儀檢測
A. 按照實驗方案進行凋亡誘導，將培養基吸出轉移至干凈離心管內（待用），PBS清洗培養瓶細胞一次。
B. 培養瓶中加入適量的胰酶消化細胞，室溫孵育至輕輕吹打可使貼壁細胞脫落，吸除胰酶消化液，避免胰酶消化過度。
注意：對于貼壁細胞，胰酶消化步驟很關鍵。胰酶消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，從而導致細胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷而出現細胞壞死的假陽性，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-熒光素的結合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。同時，胰酶細胞消化液中應盡量不含EDTA，因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結合。
C. 加入步驟A中收集的細胞培養液，將細胞輕輕吹打下來，轉移到離心管內，300g離心5min，棄上清，收集細胞，用PBS洗滌細胞一次，輕輕懸浮細胞并計數。
注意：加入細胞培養液非常重要，一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶（殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-熒光素，導致染色失敗）。
D. 取1-5× 105重懸的細胞，300g離心5min，棄上清。加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。
E. 細胞懸液中加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。
F. 輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15-20min。
G. 反應完成后立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內完成檢測。
H. 流式細胞儀檢測
2）熒光顯微鏡原位檢測
注：本方法優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于貼壁不牢而檢測不到。
A. 如果條件可以，在誘導凋亡后，用多孔板離心機300g離心5min。
B. 吸除細胞培養液，用PBS洗滌兩次（如果條件允許，在此前做步驟A）。
C. 離心后棄上清，加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。
D. 加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。
E. 移液器輕輕混勻，室溫避光孵育15-20min。
F. Annexin V Binding Buffer工作液洗滌細胞一次
G. 熒光顯微鏡檢測。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。（如果無法觀察，可以在孔板下鋪上玻片使細胞貼附，最后取出用Annexin V Binding Buffer浸潤觀察）
H. 反應完成后應立即觀察，取出貼附細胞玻片時，避免細胞干片。
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