細胞遷移與侵襲研究必備

一、Transwell實驗概述

Transwell實驗是體外研究細胞遷移和侵襲能力的經典方法，在腫瘤轉移、免疫細胞趨化、藥物篩選及細胞間相互作用等領域用得非常廣泛。

它的核心思路是用一張多孔膜把上下兩個腔室隔開，模擬細胞在趨化因子梯度驅動下的跨膜運動。

二、實驗原理

把Transwell小室想象成一個帶濾網的雙層漏斗，邏輯其實特別簡單。

上層是細胞出發的"起點"，下層藏著它們渴望的"誘餌"——通常是加了血清或特定趨化因子的培養基。細胞天生會朝營養更豐富、信號更強的方向跑，這種本能驅使它們穿過中間那層布滿微孔的聚碳酸酯膜（孔徑范圍0.4–8 μm），從上層鉆到下層。

這里最容易讓人犯迷糊的，是"遷移"和"侵襲"到底差在哪。

遷移實驗評估的是細胞的定向運動能力；侵襲實驗則需要額外包被基質膠（如Matrigel）來模擬細胞外基質（ECM），看細胞能不能降解基質、穿透膜。

實驗最后，把穿過去的細胞固定、染成深紫色，在顯微鏡下數個數。穿過去的越多，說明這群細胞要么跑得歡，要么"啃"得猛，數據就這么直觀地出來了。

三、實驗材料

這里有個極易被忽視的細節：Matrigel對溫度極度敏感，必須-20℃保存，使用前需提前一晚移至4℃緩慢融化。切忌室溫解凍或反復凍融，否則成膠不均，后續鋪膜全是徒勞。

四、實驗步驟

（一）鋪膠（僅侵襲實驗需要）

如果你做的是侵襲實驗，鋪膠就是生死線。

全程冰上操作，槍頭提前預冷。用預冷的無血清培養基把Matrigel稀釋好，每個小室加50–100 μL，動作要輕，別讓膠沾到側壁上。加完立刻水平放進37℃培養箱，靜置3小時，等它徹底凝固變硬。

手別抖，讓膠體自然流平。

（二）制備細胞懸液

鋪膠等待的時間正好同步處理細胞。挑狀態最好的對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化，看到細胞變圓收縮馬上終止。1000 rpm離心3分鐘，棄上清，用PBS洗一遍——這步是為了去掉殘留血清和死細胞碎片，別偷懶跳過。最后用無血清培養基重懸，調整密度至1×10? cells/mL。

密度一定要調準。太密了細胞擠在一起穿不過去，太稀了鏡下數不到幾個，數據沒法看。

（三）接種細胞

先在24孔板的下室加入500 μL含10% FBS或趨化因子的培養基——這是給細胞畫的"大餅"，引誘它們往下跑。再用鑷子夾住小室邊緣垂直放入孔板，確保膜面完全浸沒且沒有氣泡。往上室輕輕加入200 μL細胞懸液，注意槍頭不要戳破基質膠。

放進培養箱，培養24小時。

（四）染色與計數

1. 擦拭上室： 取出小室，用棉簽伸進上室，把膜上面沒穿過去的細胞和殘留的膠輕輕擦干凈。這一步要溫柔但果斷——擦不干凈，背景會黑成一團。

2. 固定： 把小室放進含600 μL 4%多聚甲醛的新孔里，室溫固定30分鐘。

3. 染色： 固定好后移到預先加了約800 μL 0.1%結晶紫的孔中，室溫染色20分鐘。取出后用PBS輕柔清洗2次，洗掉浮色。

4. 計數： 顯微鏡下別只盯著中間看，隨機選上、下、左、右、中央共5個視野拍照計數，呈紫色的即為穿膜陽性細胞。這樣算出來的平均值才靠譜。

五、注意事項

標準流程照著做了，數據還是慘不忍睹？問題往往藏在那些說明書沒細寫的操作細節里。

鋪膠的氣泡問題。 吸取膠液時動作要輕緩，千萬別為了排空把槍頭懟到孔底，那樣極容易卷入氣泡。膜上一旦出現氣泡，細胞就會在那兒堆積，后續計數根本沒法看。

擦拭的力度問題。 用棉簽清除上室細胞時，力度要像撫摸一樣輕柔，垂直向下輕輕滾動帶走細胞就好。聚碳酸酯膜其實很脆，稍微來點橫向力道或按壓過重，膜就破了，前面的活白干。

饑餓處理別跳過。 很多教程直接讓你消化接種，但如果細胞在富營養狀態下長得太歡，遷移數量的增加可能只是因為瘋狂分裂，而不是真的"跑"得快。建議接種前用無血清培養基讓細胞餓上12–24小時，把增殖帶來的背景噪音降下來，測出來的才是細胞真實的運動能力。

六、常見翻車現場及急救方案

結果不理想，先別急著怪細胞"不聽話"，逐條排查一下。

翻車現場一：膜面干干凈凈，一個細胞都沒有。

別光顧著延長培養時間。回頭想想：上室的細胞狀態本來就不好？無血清饑餓處理過頭把細胞"餓死"了？下室趨化因子濃度夠不夠？有些因子半衰期短，配好放久了就失效了。都排除了的話，再看看膜孔徑選得對不對——大細胞硬要鉆小孔，累死也過不去。

翻車現場二：染色后背景一片紫，分不清哪個是細胞。

大概率是結晶紫濃度太高，或者最后PBS清洗太敷衍。洗的時候水流要輕柔但得徹底，直到流下來的水變清為止。

翻車現場三：細胞在膜上聚成一團團，分布極不均勻。

多半是接種前細胞懸液沒吹打散開，或者放入小室時手抖碰歪了導致液面不平。操作時盡量保持孔板水平，加樣后輕輕晃動幾下讓細胞自然沉降，別讓它全堆在中間。