流式為什么一定要排除死細(xì)胞？
因?yàn)椤坝械募?xì)胞死了，但是尸體還在……”
雖然圈門(mén)是流式的靈魂，但排除死細(xì)胞同樣是綁定在一起的必要操作，尤其是樣本不怎么好的時(shí)候。死細(xì)胞為什么一定要排除？怎么排除？今天把這個(gè)問(wèn)題掰開(kāi)了聊。
死了，但沒(méi)完全死
很多人以為細(xì)胞死了就什么都沒(méi)了。
不是這樣的。細(xì)胞膜雖然破了，但表面的抗原蛋白往往還賴(lài)在上面沒(méi)掉干凈。這些殘留的抗原照樣能抓住你精心挑選的熒光抗體，讓儀器誤判為陽(yáng)性細(xì)胞。你測(cè)到的那個(gè)"陽(yáng)性信號(hào)"，到底是真的陽(yáng)性，還是一具尸體上掛著的殘留抗原？這是第一層麻煩。
第二層更要命。活細(xì)胞那層完整的膜就像小區(qū)保安，能把不該進(jìn)的東西擋在外面。細(xì)胞一死，"保安"下崗，染料就大搖大擺鉆進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部。這時(shí)候染料不再只結(jié)合特定靶點(diǎn)，而是像無(wú)頭蒼蠅一樣跟胞內(nèi)各種蛋白、核酸亂結(jié)合。結(jié)合量巨大，毫無(wú)規(guī)律，直接導(dǎo)致死細(xì)胞在所有檢測(cè)通道里的熒光背景都異常升高。
你在散點(diǎn)圖上看到的那些沿對(duì)角線(xiàn)拉出的詭異拖尾，或者明明不該共表達(dá)的指標(biāo)卻擠成一團(tuán)的"假陽(yáng)性群"，多半就是這幫"詐尸"的家伙在搞事情。
圖源：Thermo Fisher
那條貫穿全圖的詭異斜線(xiàn)
打開(kāi)分析軟件，有時(shí)候你會(huì)看到一群細(xì)胞沿對(duì)角線(xiàn)拉出一條長(zhǎng)長(zhǎng)的斜線(xiàn)，從左下角一路延伸到右上角。別急著以為是儀器沒(méi)調(diào)好或補(bǔ)償算錯(cuò)了——這往往就是死細(xì)胞的"杰作"。
膜破了，什么顏色的抗體它都沾一點(diǎn)，在每個(gè)通道里都有信號(hào)，強(qiáng)度還差不多，畫(huà)出來(lái)就成了這條斜線(xiàn)。
最讓人頭疼的是，它能憑空制造出根本不存在的細(xì)胞群。舉個(gè)典型例子：做外周血免疫分型，正常的CD4和CD8 T細(xì)胞應(yīng)該是互斥分布的，一個(gè)陽(yáng)性另一個(gè)就陰性。可如果樣本里混了大量死細(xì)胞沒(méi)剔除，你很可能在雙陽(yáng)性區(qū)域看到一大團(tuán)密集的"細(xì)胞群"。乍一看還以為發(fā)現(xiàn)了稀有的DP亞群，激動(dòng)半天——其實(shí)那只是死細(xì)胞上殘留抗原和非特異性吸附的抗體在"演戲"。把死細(xì)胞一去掉，那團(tuán)東西瞬間消失，正常的互斥分布立刻恢復(fù)。
如何排除死細(xì)胞？
白嫖方案：FSC/SSC光散射圈門(mén)
排除死細(xì)胞最"白嫖"的方法，就是直接利用儀器自帶的光散射信號(hào)。不用額外花錢(qián)買(mǎi)染料，也不用多占一個(gè)熒光通道，圈門(mén)時(shí)稍微留個(gè)心眼就行。
邏輯很直觀(guān)：FSC大致對(duì)應(yīng)細(xì)胞大小，SSC反映內(nèi)部顆粒度。細(xì)胞死亡后往往會(huì)皺縮，F(xiàn)SC信號(hào)下降；同時(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)崩解，SSC信號(hào)異常升高。所以在散點(diǎn)圖上，這群死細(xì)胞通常不會(huì)乖乖待在活細(xì)胞主群里，而是飄在左上方或左外側(cè)——比正常活細(xì)胞小一圈，看著卻比碎片還"渾濁"。
處理狀態(tài)不錯(cuò)的新鮮樣本時(shí)，這一招確實(shí)能過(guò)濾掉不少明顯的干擾。
但別以為萬(wàn)事大吉。光散射法有個(gè)致命軟肋：它只能識(shí)別形態(tài)已經(jīng)發(fā)生劇烈變化的細(xì)胞。現(xiàn)實(shí)中有很多細(xì)胞是"剛死不久"，膜可能已經(jīng)破了，抗原也開(kāi)始亂結(jié)合了，可外形還沒(méi)來(lái)得及皺縮，內(nèi)部顆粒度也沒(méi)顯著改變。這時(shí)候它們?cè)贔SC/SSC圖上的位置和活細(xì)胞幾乎完全重合，你想靠物理圈門(mén)剔除？做不到。這些"偽裝"極好的死細(xì)胞一旦混進(jìn)分析群，照樣制造假陽(yáng)性，把弱陽(yáng)性信號(hào)淹沒(méi)得干干凈凈。
所以，樣本稍微復(fù)雜一點(diǎn)，或者對(duì)數(shù)據(jù)精度有要求，光散射這一招遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。
精準(zhǔn)打擊：核酸染料 vs 胺活性染料怎么選？
死活染料的選擇，本質(zhì)上是一場(chǎng)關(guān)于"膜完整性"和"后續(xù)步驟"之間的博弈。
核酸染料（PI、7-AAD、DAPI），邏輯非常直白：它們進(jìn)不去活細(xì)胞的門(mén)，只能趁死細(xì)胞膜破了鉆進(jìn)去結(jié)合核酸發(fā)光。便宜好買(mǎi)，染完直接上機(jī)，適合那些只看表面標(biāo)記、做完立刻分析的簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)。
但有個(gè)"一次性"限制：不能洗，不能固定。清洗可能把結(jié)合不牢的染料洗掉導(dǎo)致假陰性；固定更麻煩——甲醛或甲醇一處理，所有細(xì)胞的膜都被打穿，原本健康的活細(xì)胞也會(huì)把這些染料吞進(jìn)去，全員陽(yáng)性，數(shù)據(jù)直接報(bào)廢。
胺活性染料的玩法完全不同。它是沖著蛋白質(zhì)去的，專(zhuān)門(mén)跟細(xì)胞表面的伯氨基發(fā)生共價(jià)結(jié)合。活細(xì)胞里，染料只停留在表面，結(jié)合位點(diǎn)有限，熒光弱；細(xì)胞一死，膜屏障消失，染料長(zhǎng)驅(qū)直入，跟胞內(nèi)海量蛋白結(jié)合，熒光強(qiáng)度瞬間飆升幾個(gè)數(shù)量級(jí)。死活分群清晰得像刀切一樣。
最關(guān)鍵的是，共價(jià)結(jié)合就像把染料"焊"在了細(xì)胞上，后面怎么固定、怎么破膜、怎么洗滌，信號(hào)都穩(wěn)穩(wěn)的。所以面對(duì)復(fù)雜的胞內(nèi)染色方案，或者擔(dān)心樣本處理過(guò)程中細(xì)胞狀態(tài)波動(dòng)，多花一點(diǎn)成本選用支持固定的胺活性染料，往往能在關(guān)鍵時(shí)刻把數(shù)據(jù)從混亂的邊緣拉回來(lái)。再好的抗體組合，也經(jīng)不起死活不分的折騰。
圖源：Proteintech
到底什么時(shí)候該加？什么時(shí)候可以省？
死活染料挺貴的，是不是每次都得加？沒(méi)必要搞一刀切，關(guān)鍵看兩個(gè)維度：樣本成色和實(shí)驗(yàn)精細(xì)度。
新鮮外周血、狀態(tài)不錯(cuò)的脾臟單細(xì)胞懸液，只要操作輕柔，死細(xì)胞比例通常很低，F(xiàn)SC/SSC圈門(mén)基本夠用，省下試劑錢(qián)完全合理。
但場(chǎng)景一旦切換，邏輯就得變。腫瘤組織、難消化的實(shí)體器官、剛從液氮里撈出來(lái)的凍存細(xì)胞——那種"死細(xì)胞滿(mǎn)天飛"的場(chǎng)面，光靠物理散射根本分不開(kāi)，必須上染料做化學(xué)層面的精準(zhǔn)剔除。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本身也是決定因素。跑二十色以上的面板，通道間的背景干擾本來(lái)就如履薄冰；要抓弱表達(dá)抗原，信號(hào)本就微弱；涉及胞內(nèi)染色，必須經(jīng)歷破膜步驟——這些情況下，死活染料不是錦上添花，是保命符。尤其做胞內(nèi)染色時(shí)，普通核酸染料一破膜就全染了，只能選胺活性染料，雖然成本高點(diǎn)，但能把非特異性吸附造成的假陽(yáng)性徹底洗干凈。
為了省一點(diǎn)試劑費(fèi)，讓辛苦調(diào)好的電壓和補(bǔ)償因?yàn)橐蝗?quot;詐尸"的死細(xì)胞前功盡棄，這筆賬怎么算都不劃算。
排死細(xì)胞沒(méi)有玄學(xué)，全看你的樣本多爛，以及你想讓數(shù)據(jù)多好看。
樣本新鮮、指標(biāo)強(qiáng)表達(dá)、通道不多——FSC/SSC圈門(mén)足矣。樣本狀態(tài)差、弱表達(dá)、多色面板、胞內(nèi)染色——老老實(shí)實(shí)加死活染料，別心疼那點(diǎn)錢(qián)。
你在做流式時(shí)遇到過(guò)最離譜的假陽(yáng)性是什么？平時(shí)習(xí)慣用哪種死活染料？有沒(méi)有因?yàn)橥尤玖戏^(guò)車(chē)？
