細胞破碎后的裂解液極其粘稠是什么原因？如何高效解決？

在蛋白表達中，破碎細胞后有時會出現裂解液極其粘稠的問題，導致后續離心不徹底以及堵塞重力柱，從而顯著減少目標蛋白的回收率。

今天從原因、解決方法以及前期如何預防三個方面來聊聊這個問題。

01. 裂解液粘稠的原因是什么？

最根本的原因是基因組DNA的大量釋放。

無論是原核生物還是哺乳動物細胞，內部都含有分子量極大的雙鏈DNA。當高壓勻漿或超聲的剪切力破壞了細胞核或擬核后，這些長鏈大分子就會釋放到緩沖液中。它們在水相中會完全舒展并相互交錯，形成復雜的網狀膠體結構，直接導致宏觀上溶液粘度增加。

這種核酸聚合物網絡不僅會增加液體的粘滯阻力，還會帶來嚴重的包裹效應。

當物理破碎不夠徹底時，未被打斷的長鏈DNA會把目標蛋白、未破壁的細胞碎片以及不溶性包涵體纏繞在一起。這使得常規轉速的離心根本無法將固液兩相分離，上清液自然會呈現渾濁狀態。如果直接將這種體系上樣，DNA網絡會糊在層析介質表面，造成柱壓上升并堵塞填料的微孔。

02. 如何解決該問題？

解決粘稠問題最溫和高效的手段是添加核酸酶進行特異性降解。

在細胞重懸后或剛完成破碎后，向體系中加入全能核酸酶或高純度的去氧核糖核酸酶。這類內切酶會迅速切斷核酸骨架上的磷酸二酯鍵，將長鏈大分子降解成只有幾個堿基的寡核苷酸短片段。通常在冰上或室溫孵育二十分鐘左右，就能肉眼觀察到裂解液恢復清澈流暢。不過這類酶大多依賴鎂離子等二價陽離子，因此緩沖液中必須補充適量的鎂鹽，同時絕對不能添加乙二胺四乙酸這類金屬離子螯合劑。

如果下游的純化工藝嚴格限制外源蛋白酶的引入，就只能通過強化物理剪切力來硬性打斷核酸鏈。

比如在使用超聲破碎儀時，可以適當調高振幅并延長總工作時間，前提是必須設置足夠的脈沖停頓間隙并全程維持冰水浴。若是使用高壓勻漿破碎，可以將工作壓力提升至1000 bar以上，或者讓粗提液多循環兩到三次。通過均質閥內部產生的極高機械剪切力，可以強行將基因組打碎到不再引起膠體化的極短片段。

對于大體積純化或粗提階段，也可以利用多聚陽離子進行化學沉淀。

向發粘的裂解液中緩慢滴加聚乙烯亞胺或硫酸鏈霉素，這些帶有強正電荷的試劑能與核酸骨架上的負電荷發生強烈的靜電中和。生成的絡合物極不溶于水，在常規低速離心時就能跟細胞碎片一起沉淀到底部。這不僅能立刻減少液體的高粘度狀態，還能清除非目標核酸，極大減輕后續離子交換層析的雜質負擔。

03. 實驗操作中如何預防與優化？

很多時候裂解液粘稠是因為起始的細胞重懸濃度過高。

比較合理的比例是每一克濕菌體至少加入三到五毫升的裂解液。將細胞懸液進行適當稀釋，能從源頭上稀釋破碎后釋放出的核酸絕對濃度，局部粘度就不會急劇升高，后續的離心分層也會容易很多。

緩沖液體系的離子強度和全流程控溫也很關鍵。

在裂解液中提前配制幾百毫摩爾濃度的氯化鈉，可以充分提供靜電屏蔽效應，削弱長鏈核酸與帶正電的雜蛋白之間的非特異性吸附，讓目標蛋白更容易游離出來。此外，破碎過程中產生的局部高熱極易導致蛋白變性，這些熱變性的蛋白絮狀物一旦和核酸混雜在一起會形成復合物，因此可以提前預冷所有耗材并全程做好降溫。