未知樣品的HPLC色譜方法建立SOP

建立新的HPLC方法，往往是因為：

① 原方法分離效果差；

② 沒人做過，查不到具體方法；

③ 未知化合物的方法開發。

我們以未知化合物為例介紹一下液相色譜的方法開發的大致流程。

一、分離模式的選擇

我們先測試樣品的溶解性：

1. 如果在烷烴試劑中溶解性好，那么可首選正相模式開發方法，色譜柱主要以硅膠柱為主，流動相可以選擇正己烷-乙醇；

2. 如果在二氯甲烷或丙酮中溶解性好，那么可以選用正相模式，或者反相模式中的純有機模式，色譜柱可以用硅膠柱、C18或C8，反相的流動相可以用甲醇-乙腈、乙腈-二氯甲烷；

3. 如果在水、甲醇或乙腈中溶解性好，那么可以選用反相模式、Hilic模式或離子交換模式，反相流動相可以用水-甲醇、水-乙腈，HILIC的流動相可以用乙腈-水，離子交換流動相可以用緩沖鹽濃度梯度洗脫、或pH的梯度洗脫。

二、色譜柱規格的選擇

根據樣品組分的復雜程度，分離的難易程度，選擇不同規格的色譜柱。

1. 在分離度要求不高的前提下，可以用5um粒徑的常規4.6?250mm的色譜柱，柱壓較低；

2. 對于分離要求高，且容易污染，柱壓高的分離項目，可以嘗試同等粒徑的實心核填料的色譜柱，柱效與小粒徑填料的色譜柱相當，但柱壓更低，隨著污染柱壓升高的空間比較大；

3. 對于難分離的，可以選擇更小粒徑，比如2.5um以下粒徑，超高效液相色譜（UHPLC）。

三、反相流動相pH的選擇

水溶后，pH試紙看一下pH：

1. 如果成酸性，我們選擇流動相的pH2~3；

2. 如果成堿性，我們選擇流動相pH8~9。

四、檢測器的選擇

1.確定待測物結構上是否有紫外強吸收化學鍵（異戊二烯），可以用DAD檢測器看一下紫外吸收強度范圍，選取合適的分析波長；

2.如果沒有紫外吸收：

① 可以考慮示差折光檢測器（RI）；

② 如果待測物沸點較高（大于400℃），則可以選擇蒸發光散射檢測器（ELSD）或電噴霧檢測器（CAD）；

3.如果化合物沒有紫外吸收，但有顏色，可能更適合可見光波長下檢測；

4.如果需要確定分子量，可以連接質譜檢測器。

五、流動相梯度條件的確定

我們可以先跑一個大梯度，比如反相用水和乙腈流動相，可以用乙腈的比例從10%逐漸增至90%，根據出峰情況，再去優化放緩梯度。

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