色譜分離純化方法建立一般步驟

色譜分離純化方法建立的一般步驟包括：

1.明確分離目標與樣品特性，并確定目標物純度分析方法；

2.保留：篩選分離模式、流動相種類，使目標化合物有保留且能洗脫；

3.峰形：優化分離參數改善峰形；

4.分離：優化分離參數改善分離；

5.放大制備。

1.樣品來源：了解樣品的組成，基質成分，確定是否需要做前處理。

2.樣品溶解性：根據樣品的溶解性可以大致確定主成分的極性，幫助選擇分離模式及流動相。可以通過對少量樣品，用不同試劑溶解測試。

3.目標組分的pKA：如果可以查到pKA，能指導流動相pH的選擇，也可以水溶解后，測試其溶液pH。

4.目標組分的logP：油水分配系數，可以判斷其疏水性及保留強度，指導流動相溶劑及比例的設定。

5.目標組分的穩定性：對溫度、pH、有機相、光照、氧氣等條件的穩定性，避免目標物降解。

02—保留

根據樣品主成分及目標物的性質，選擇分離模式，使目標物得以保留，并選擇合適流動相將其洗脫。

選好分離模式后，如果目標物與干擾雜質分離比較遠，比較好分離就可以直接分析條件放大到制備條件，進行分離純化。

03—峰形

如果在分析條件下能分離，這時要在分析色譜柱上加大上樣量（一般0.5mg）看峰形變化，如果峰形變差，難以與干擾物分離，則需優化流動相pH、樣品溶劑及pH等參數改善峰形才能上制備色譜。

如果初始測試條件，分離較差，優化參數步驟如下：

1.優化流動相比例或梯度液相色譜方法優化——梯度的優化

2.調節流動相pH或更換有機相

3.篩選不同修飾的鍵合相

根據需要分離的單次上樣量，選擇合適規格的制備柱，并計算出流速

16種規格色譜柱的流速及樣品量換算列表

進行放大上樣測試。