死細胞標記：碘化丙啶（PI）無法穿透完整細胞膜，進入膜受損死細胞與DNA結合發紅色熒光。

通過熒光顯微鏡或流式細胞儀區分活細胞（綠色）與死細胞（紅色），計算細胞存活率或毒性。

一、實驗準備

1.操作臺準備

超凈臺紫外照射30min；紫外滅菌結束后，關閉紫外，打開風機，通風10min；用酒精棉球擦拭臺面，點燃酒精燈

2.試劑與材料

? 試劑盒組分：Calcein-AM（干粉或溶液）、PI溶液、PBS緩沖液（注意！：提前解凍）

? 耗材：黑色/透明96孔板、移液槍、微量離心管（如1.5ml）

二、實驗步驟

1 細胞處理

? 細胞長至90%，接種于多孔板（如96孔），待細胞24h貼壁后一加藥處理一加藥后24h，觀察細胞生長狀態，吸棄培養基，用預溫PBS輕洗1~2次（避免細胞脫落）。

識接種量：96孔板建議每孔3k-5k細胞（過密會致細胞卷邊，同時避免過密致假陽性）

? 鋪板均勻：可用寫“米”字法搖勻孔板，關乎到后續拍攝效果

2 染色工作液配制

按試劑盒說明配置染色工作液，嚴格避光，現用現配！！！

（如碧云天 AM:PI：緩沖液=1:1:1000）

3 染色孵育

向孔內加入染色劑，37°C避光孵育 15~30分鐘。

4 洗滌與檢測

? 吸棄染色液，PBS清洗1次（減少背景）。

? 在熒光顯微鏡下觀察染色效果，活細胞呈綠色（激發/發射波長：494/517nm），死細胞呈紅色（激發/發射波長：535/617 nm）。

！注意：避免長時間曝光，防止熒光淬滅。

三、注意事項

1.避光操作：Calcein-AM和PI均對光敏感，全程避光保存及使用。

2.染色液穩定性：Calcein-AM工作液需現配現用（30分鐘內），避免酯酶降解。

3.背景干擾：徹底吸棄培養基殘留（血清中酯酶可能水解Calcein-AM，導致背景升高）。若使用含酚紅的培養基，建議用PBS替代染色液溶劑。

4.及時檢測：Calcein熒光隨時間減弱，建議染色后1小時內完成檢測。