大鼠骨髓來源單核/巨噬細(xì)胞BMDMs提取步驟

1. BMDMs

骨髓來源單核/巨噬細(xì)胞（Bone marrow-derived macrophages, BMDM）和腹腔巨噬細(xì)胞、外周血巨噬細(xì)胞（PBMCs）一樣，常用作單核/巨噬細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

在用作實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象時(shí)，一般不特別區(qū)分，都認(rèn)為是M0細(xì)胞。

BMDMs起源于造血干細(xì)胞，在骨髓中通過單核細(xì)胞系分化而來，是原代細(xì)胞，沒有自我更新能力。在組織炎癥或損傷時(shí)可遷移并分化為巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室一般常用的可增殖分裂的巨噬細(xì)胞系有人巨噬細(xì)胞系THP-1，小鼠的raw267.4等。通常做完永生化細(xì)胞系中分子生物學(xué)變化后，還需要在原代細(xì)胞上去驗(yàn)證。

骨髓來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)7天分化為巨噬細(xì)胞，可用于研究巨噬細(xì)胞極化。

2. 實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物、試劑和相關(guān)器械

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8 ～ 12周齡的SD大鼠

試劑：M-CSF（商品化的誘導(dǎo)因子）或L929細(xì)胞系培養(yǎng)上清、含10%血清的H-DMEM培養(yǎng)基或RIPM 1640培養(yǎng)基、75%乙醇、無菌PBS

實(shí)驗(yàn)器械：1mL注射器、剪刀、鑷子、70 μm細(xì)胞濾器，15 mL離心管、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板

3. 細(xì)胞因子M-CSF的獲取

M-CSF是一種誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，獲取途徑有兩種：

 一般就 M-CSF（30 ng/mL）培養(yǎng)5~ 7 天，即得到 M0 型巨噬細(xì)胞

4. 骨髓巨噬細(xì)胞分離

提前準(zhǔn)備好冰、冰盒，在超凈臺(tái)準(zhǔn)備好需要的培基

大鼠：

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

實(shí)驗(yàn)儀器：眼科剪，彎鑷，直鑷，組織鑷（有齒），輔料鑷（平鑷），鋒利的大剪刀，圓形10 cm玻璃皿，這些要提前高溫高壓滅菌備用。1 mL的無菌注射器2~3個(gè)，5 mL的無菌注射器2~3個(gè)，圓形10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，50 mL離心管（大約2只大鼠可合并為一個(gè)，分開提取就一只一個(gè)離心管）。

提前開啟制冰機(jī)，準(zhǔn)備好冰平板，提取細(xì)胞過程，培養(yǎng)皿最好放在冰平板上。冰不要放到超凈臺(tái)里面，可噴酒精或滅菌液后放在邊緣。冰平板可噴75%酒精滅菌后放到超凈臺(tái)中。

準(zhǔn)備大鼠：選擇8～ 12周齡的SD大鼠進(jìn)行骨髓巨噬細(xì)胞的提取，會(huì)多一些。提取過程在原代細(xì)胞臺(tái)中進(jìn)行，在冰上操作，降低細(xì)胞代謝，避免細(xì)菌污染。

戊巴比妥鈉腹腔注射過量麻醉處死大鼠。并將大鼠浸泡在75%酒精中全身消毒5 min，然后轉(zhuǎn)移身體到原代細(xì)胞臺(tái)內(nèi)冰板上操作；

麻醉劑量：麻醉劑量為40–50 mg/kg（深度麻醉），一只400 g大鼠，大約給0.4*40-0.4*50=16-20 mg，戊巴比妥鈉通常配制為3%濃度（30 mg/mL），那么注射體積為16或20 / 30=0.533或0.666 mL，過量麻醉時(shí)需多打一些（如800 μL）。然后用每只大鼠需要?jiǎng)┝?大鼠數(shù)量，即可得到需要配制的藥物體積，也可直接多配，滅菌保存之后再使用。

藥物配制：戊巴比妥鈉用于鎮(zhèn)靜、催眠、麻醉前給藥。藥物粉末首先稱重，用無菌生理鹽水或滅菌PBS在超凈臺(tái)里配制，避光，密閉保存。實(shí)驗(yàn)室一般用錫紙包裹住容器，寫上配制濃度和名字，放在4℃。也可以在外面配制，渦旋混勻后，在超凈臺(tái)里用0.22 μm的過濾器過濾（除菌），保存?zhèn)溆谩?/span>

大鼠配制3%，小鼠配制1%（10 mg/mL）的戊巴比妥鈉溶液（小鼠體重小，可以增加注射體積）

2. 我們需要提取大鼠長(zhǎng)骨骨髓中的BMDMs，先認(rèn)識(shí)一下大鼠的四肢骨：前肢由臂骨、橈骨、尺骨等組成，后肢包括股骨、脛骨、腓骨等。

大鼠的前肢和后肢的長(zhǎng)骨都可以提取BMDMs，但是前肢比較短，前肢的臂骨（靠近胸腔的那一節(jié)骨）比較短且難取，前肢的尺骨和橈骨靠得很近，有時(shí)也可以取。

大鼠后肢的股骨和脛骨通常是提取BMDMs的部位，可提取到的細(xì)胞更多。靠近腹部的是股骨，越過大鼠下肢關(guān)節(jié)是脛骨和腓骨。都比較好分離。

以下圖片僅供實(shí)驗(yàn)參考。

如圖1和2所示，鼠前肢依次是臂骨、肘關(guān)節(jié)、尺骨和橈骨（這兩者靠得很近，實(shí)際上不太能分開）；鼠后肢依次是股骨、股髕關(guān)節(jié)、股脛關(guān)節(jié)、脛骨和腓骨（腓骨比較細(xì)）

圖3. 鼠Ct平面圖（圖片來源：vet-Anatomy_IMAIOS）

圖3展示了鼠前肢和后肢的肌肉位置和部分骨骼

后肢股骨分離：找到大鼠下腹部的髂骨附近，找到它和腹中線的交點(diǎn)，用有齒的組織鑷提起皮膚，用大剪刀斜著往下肢方向剪去，輕輕剪開下腹部皮膚與肌肉（盡量不要剪破腹膜暴露內(nèi)臟），繼續(xù)延長(zhǎng)剪口至下肢，用有齒鑷子夾住股骨上方的組織，頓性分離肌肉和筋膜，暴露股骨，用眼科剪斷附著的肌腱，并剔除股骨上的肌肉，剔除過程中注意避免破壞股骨骨髓腔的完整性。

大鼠的股骨上端是膨大的股骨頭，與髂骨的髖臼相連組成髖關(guān)節(jié)；股骨的下端與髕骨、下肢的脛骨一起組成膝關(guān)節(jié)。股骨上端隱藏比較深，有時(shí)候比較難暴露，在分離股骨下端后，可用剪刀離斷股骨上端，立即將 SD 大鼠股骨浸泡于含雙抗的 1×PBS 或細(xì)胞培養(yǎng)基的皿中；

股骨上附著的組織一般不是很多，因此比較干凈，可以迅速涮洗一遍后轉(zhuǎn)移到新的皿中。皿要放在冰上，裝有含雙抗的 1×PBS 或細(xì)胞培養(yǎng)基。

后肢脛骨和腓骨分離：大鼠BMDMs的提取來源，最重要的是脛骨。脛骨是長(zhǎng)骨，比股骨更好分離。腓骨很細(xì)，中空，在脛骨旁邊，可直接用鑷子離斷。

如同股骨分離操作，剪開皮膚和肌肉后，組織鑷頓性分離肌肉，眼科剪剪去肌腱附著，直鑷夾住脛骨，上端頓性和膝關(guān)節(jié)分離，下端也可頓性分離。用眼科剪剪去長(zhǎng)骨上附著的組織。立即浸泡于含雙抗的 1×PBS 或細(xì)胞培養(yǎng)基中清洗一遍，立即轉(zhuǎn)移到新的皿中。

前肢尺骨和橈骨分離：大鼠前肢一般可用尺骨和橈骨提取BMDMs，臂骨也可以，但分離難度相對(duì)后肢較難一點(diǎn)，因附著的筋膜和肌腱比較復(fù)雜且骨比較彎曲。相比前兩步，可獲得的細(xì)胞量比較少。每個(gè)骨實(shí)際提取的細(xì)胞量可能和腓骨差不多，合起來數(shù)量也可以。

臂骨也是隱藏比較深，要先找到關(guān)節(jié)處，再辨別，具體的可以在實(shí)際操作中自行調(diào)整。

3.沖出骨髓相關(guān)細(xì)胞   

以脛骨為例，更換新的滅菌過的大剪刀，剪掉脛骨兩端骨骺，1mL 注射器吸取含雙抗的 DEME 培養(yǎng)基，將脛骨內(nèi)骨髓沖出，重復(fù)2~3次。并用注射器或1 mL槍頭充分吹打骨髓液，直到無肉眼可見的團(tuán)塊（紅色團(tuán)塊要吹散，除了明顯的組織碎片外），獲得細(xì)胞懸液；  

其它的骨也可參照操作。兩端的骨骺或股骨頭中有較多的單核細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等等，想獲得比較多的單核細(xì)胞，也可以盡量保留骨骺。

4. 純化骨髓單核細(xì)胞

獲得3中的細(xì)胞懸液后，可以用注射器或1 mL槍頭吸取細(xì)胞懸液，無菌細(xì)胞篩（可以用70 μm的細(xì)胞篩）細(xì)胞過濾器過濾，以去除其它組織碎片。然后800 rpm，低溫離心 5 min，收集細(xì)胞沉淀并用培基重懸；

下一步是裂解紅細(xì)胞，不過作者提取時(shí)沒有裂解過，大家可以參考以下找到的資料：

加入紅細(xì)胞裂解液重懸，充分吹打細(xì)胞懸液將其混勻，置于 4°C冰上孵育 5 min，以達(dá)到完全裂解紅細(xì)胞的目的，然后加入等體積的PBS，離心獲得細(xì)胞沉淀，重懸，洗滌一次。

5. BMDMs誘導(dǎo)和鋪板

貼壁法純化單核細(xì)胞：

①預(yù)貼壁，這一步目的是去除已分化的破骨細(xì)胞等：將重懸的細(xì)胞懸液放在10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱放置1~2 h后，取上層的細(xì)胞懸液（千萬不要丟掉哦），800 rpm離心收集細(xì)胞；

②BMDMs誘導(dǎo)分化  用含M-CSF的完培重懸（30 ng/mL M-CSF+體積分?jǐn)?shù) 10% 胎牛血清 +1% 雙抗 ），或含15%~20% L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以合適的密度接種于孔板；

③2~3天后加新培基，繼續(xù)培養(yǎng)到5~7天，有時(shí)候第4天鏡下也可觀察到較多的貼壁細(xì)胞。之后，給細(xì)胞更換含藥物或細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

一般一只大鼠提出的BMDMs還挺多的，可以分成2~3個(gè)10 cm皿去預(yù)貼壁，避免太過擁擠影響效果。

孔板中，剛剛鋪板的單核細(xì)胞鏡下看容易成團(tuán)，圓形。分化后的細(xì)胞開始貼壁。鋪板時(shí)太稀或太擠都不適合。

6. BMDMs形態(tài)和誘導(dǎo)確認(rèn)

一般認(rèn)為M-CSF和L929上清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞是M0細(xì)胞，可通過CD68（大鼠），F(xiàn)4/80（小鼠）免疫熒光確認(rèn)。

M2是Arg1，M1是iNOS

下面圖片來源于：Cell Image Library (CIL)

Digital Object Identifier (DOI) doi:10.7295/W9CIL35133

原作者提取了小鼠股骨來源的巨噬細(xì)胞，記錄了巨噬細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)時(shí)的形態(tài)，和實(shí)際里巨噬細(xì)胞形態(tài)很相似，故放上來參考。這是巨噬細(xì)胞。