倒平板、劃平板、涂布：微生物純培養的操作

在微生物學研究的微觀世界里，分離、純化和培養特定微生物是探索其奧秘的第一步。倒平板、劃平板和涂布平板這三種基礎操作，如同精巧的“微生物外科手術”，構成了獲取純培養物的核心技能。它們看似簡單，卻是實驗成敗的關鍵。

核心靈魂：無菌操作

無論進行哪種操作，無菌操作都是貫穿始終的鐵律。所有操作需在酒精燈火焰附近的無菌區進行：

培養皿、培養基、工具預先滅菌。

操作前雙手、臺面嚴格消毒。

試管、培養皿開啟或關閉時，管口/皿蓋需快速掠過火焰。

使用后接種環/涂布棒必須徹底灼燒滅菌，避免交叉污染。

目的： 將熔化的固體培養基無菌傾倒入培養皿，冷卻凝固形成均勻平板，為后續接種提供生長基底。

關鍵材料：

已滅菌的瓊脂培養基（加熱熔化并冷卻至約45-50℃，手感溫熱但不燙手）。

滅菌的培養皿。

操作步驟：

1、準備： 點燃酒精燈，在火焰旁的無菌區操作。取出滅菌培養皿，皿蓋微開置于一側。

2、取培養基： 手持熔化并冷卻至適宜溫度的培養基試管（如三角瓶），在火焰上灼燒管口和蓋子。

3、傾倒： 將試管口靠近火焰，打開蓋子，迅速將適量培養基（約15-20mL，鋪滿皿底形成適當厚度）傾倒入培養皿底部。傾倒時避免培養基沾到皿蓋或皿壁上緣。

4、覆蓋與冷卻： 立即蓋上皿蓋，輕輕水平旋轉或前后左右傾斜培養皿，使培養基均勻鋪滿皿底。

5、凝固： 靜置在水平臺面上，待瓊脂完全凝固（通常室溫下10-15分鐘）。

6、標記與儲存： 在皿底標記培養基名稱、日期等信息。凝固后若暫時不用，可倒置（防止冷凝水滴落）于4℃冰箱保存。

關鍵點與常見問題：

溫度： 培養基過熱（>55℃）易產生過多冷凝水或燙死后續接種的微生物；過冷（<45℃）則易凝固無法倒平或產生凝塊。

厚度： 太薄易干裂，太厚影響觀察和分離效果。

均勻性： 旋轉/傾斜務必輕柔，確保厚度一致。

冷凝水： 倒好的平板常有冷凝水，使用前可倒置于37℃培養箱短時烘干（約30分鐘）。

應用： 制備用于劃線分離、涂布、點種或傾注培養的固體平板。

目的： 利用分區劃線技術，將混合菌樣或含菌樣品在平板上進行梯度稀釋，最終分離得到單個、孤立的菌落（純培養物）。

關鍵材料：

制備好的無菌固體平板。

接種環（鉑金或鎳鉻絲）。

菌種（斜面培養物、液體培養物或樣品懸液）。

操作步驟：

1、滅菌接種環： 手持接種環，將金屬環部分置于酒精燈外焰徹底燒紅，再灼燒可能進入試管的金屬桿部分，冷卻（可接觸無菌瓊脂或空氣中靜置數秒）。

2、取樣： 灼燒菌種管口，用冷卻的接種環蘸取少量菌樣。若為液體樣品，需確保環內形成菌膜但不滴落。

3、第一次劃線（A區）：

左手持平板，開啟約30度角（避免空氣中雜菌落入）。

將沾菌的接種環在平板邊緣約1/4區域（A區）輕輕、密集地“之”字形劃線數次，約占平板面積的1/4-1/3。劃線時環與平板表面呈約30度角，輕柔接觸，避免劃破瓊脂。

4、滅菌接種環： 灼燒接種環至紅熱，冷卻。

5、第二次劃線（B區）：

將冷卻環接觸A區末端劃線的1-2次，然后在緊鄰A區的空白區域（B區）劃線。劃線范圍約占剩余面積的1/2，劃線方向與A區有一定交叉（如垂直或斜交），線條間留有間隙。

6、滅菌接種環與后續劃線（C/D區）：

再次灼燒接種環，冷卻。

接觸B區末端1-2次，在剩余空白區域（C區）劃線。線條更稀疏，覆蓋剩余大部分面積。

如需進一步稀釋（樣品含菌量高），可灼燒后劃最后一個D區。

7、完成： 蓋上皿蓋，灼燒接種環。標記平板（樣品信息、日期、操作者）。

8、培養： 倒置于適宜溫度培養箱培養。

關鍵點與常見問題：

冷卻： 接種環必須充分冷卻再取菌/劃線，否則會燙死微生物。

分區與稀釋： A區要密，后續區域逐漸稀疏并接觸前一區末端，實現有效稀釋。

角度與力度： 保持適當角度，輕柔接觸表面，避免劃破瓊脂。

滅菌： 每劃完一個區域必須徹底滅菌接種環，是分離成功的關鍵。

單菌落： 理想狀態是在C區或D區獲得分散良好的單菌落。

應用： 從混合樣品中分離純化單菌落，是獲取純培養物的最常用方法。

目的： 將一定體積的含菌液體樣品（或稀釋液）均勻涂布在已凝固的平板表面，主要用于活菌計數或需要菌苔均勻生長的實驗。

關鍵材料：

制備好的無菌固體平板（表面需干燥，無過多冷凝水）。

含菌液體樣品（常為系列稀釋液）。

滅菌的玻璃涂布棒（L型彎頭）或一次性塑料涂布棒。

微量移液器及滅菌槍頭。

操作步驟：

1、樣品準備： 準備好適當稀釋度的含菌液體樣品。

2、加樣： 用移液器吸取一定體積（通常0.1mL或0.2mL）的樣品，輕輕滴加在平板中央。

3、滅菌涂布棒： 將涂布棒浸入70%酒精中，取出后在酒精燈火焰上引燃（無需燒紅），燃盡酒精后稍冷卻幾秒（或酒精灼燒后待酒精揮發完）。

4、涂布：

左手持平板，開啟小角度。

將滅菌冷卻的涂布棒接觸平板邊緣無培養基處（吸走多余酒精/降溫）。

將涂布棒輕輕置于平板中央的液滴上，先不移動，讓液體被瓊脂吸收片刻。

快速、輕柔地旋轉平板（或用涂布棒作放射狀、同心圓運動），同時用涂布棒將液體均勻地涂布至整個平板表面。確保樣品覆蓋所有區域，且液體被瓊脂充分吸收。

5、完成： 蓋上皿蓋。涂布棒重新浸入酒精中消毒。標記平板（樣品、稀釋度、體積、日期）。

6、干燥與培養： 靜置數分鐘待表面液體完全吸收（或倒置于培養箱短時烘干），然后倒置培養。

平板干燥： 表面冷凝水過多會稀釋樣品或導致菌落蔓延。使用前需干燥處理。

涂布棒滅菌與冷卻： 必須充分滅菌，并適當冷卻，避免燙死微生物。酒精灼燒法高效常用。

涂布技巧： 動作要快而輕柔，確保樣品均勻分布，不劃破瓊脂。避免液體濺到皿蓋或邊緣。

加樣體積： 通常0.1-0.2mL，過多不易涂勻且影響吸收。

靜置吸收： 加樣后稍等再涂布，有助于液體滲入瓊脂，減少流動。

應用： 主要用于菌落計數（計算每毫升樣品中的活菌數 - CFU/mL）、抗生素敏感性試驗（紙片法/K-B法）、需要菌苔均勻生長的實驗（如噬菌體效價測定）。

注意事項：

安全第一： 嚴格遵守實驗室生物安全規范。處理未知或潛在致病微生物應在相應等級（BSL-1/2）生物安全柜中進行。廢棄物（如污染平板、槍頭）必須按生物危害廢棄物處理。

溫度敏感性： 倒平板溫度、過熱接種環對微生物的殺傷是關鍵控制點。

耐心與練習： 無菌操作和劃線/涂布技巧需要反復練習才能熟練掌握。失敗是常事，分析原因（污染？劃線不當？涂布不均？）是進步的階梯。

記錄： 詳細記錄實驗步驟、樣品信息、稀釋度、培養條件等至關重要。

倒平板、劃平板與涂布操作，是打開微生物世界大門的三把鑰匙。通過不斷磨礪這些基礎技藝，研究者得以分離出純凈的菌株，精確量化微生物群體，為后續的鑒定、生理生化研究及更深入的探索鋪平道路。掌握其精髓，方能在這肉眼不可見的王國里游刃有余。