微生物瓷珠菌種保存法的操作步驟與注意事項！

微生物瓷珠菌種保存法是一種非常方便、可靠且長期保存菌種的方法，尤其適用于細菌和酵母。其核心是將濃菌液吸附到內含冷凍保護劑的多孔瓷珠上，然后超低溫冷凍保存。以下是詳細的操作步驟和關鍵的注意事項：

將高濃度的微生物懸液與內含冷凍保護劑（通常是甘油或其他專用配方）的瓷珠混合，微生物和保護劑滲入瓷珠微孔。超低溫冷凍后，使用時只需取出一顆瓷珠即可快速復蘇微生物，避免反復凍融主保存管。

操作步驟：

1、準備工作：

材料： 無菌瓷珠保存管（內含冷凍保護液和若干瓷珠，如20-25顆）、無菌移液管或吸頭、無菌生理鹽水或適宜的液體培養基、無菌鑷子（可選）、待保存的純培養微生物（對數生長期最佳）、比濁儀（麥氏標準管或分光光度計）、標記筆、低溫防護手套、-70℃至 -80℃超低溫冰箱或液氮氣相。

環境： 無菌操作臺（生物安全柜）。

微生物準備： 從新鮮的、活力良好的平板上挑取單菌落（通常18-24小時培養的細菌/酵母），確保純度。

2、制備濃菌懸液：

在無菌操作臺中，向裝有少量（約0.5-1 ml）無菌生理鹽水或液體培養基（如TSB、BHI等，確保不含抑制劑）的小試管或EP管中加入適量菌落。

用無菌接種環或旋渦混合器充分混勻，制成均勻、濃稠的菌懸液。關鍵點：菌懸液濃度要達到或超過 0.5 麥氏濁度標準（約 1.5 x 10^8 CFU/ml 或更高）。 濃度不足會導致保存失敗或復蘇困難。使用比濁儀準確測量。

3、轉移菌懸液到瓷珠管：

打開無菌瓷珠保存管的蓋子（通常有兩個蓋子：外蓋和內蓋/篩網蓋）。

用無菌移液管吸取步驟2中制備好的濃菌懸液（通常需要0.5 ml，務必遵循具體品牌說明書要求的體積），小心地加入到瓷珠保存管中。確保液體完全覆蓋瓷珠。

注意： 切勿將固體瓊脂塊或過多液體加入，以免改變保護劑濃度或堵塞篩網。

4、混合與吸附：

蓋緊瓷珠管的內蓋（篩網蓋）。確保密封。

用力上下顛倒或旋渦振蕩瓷珠管數次（通常10-15秒），使菌懸液與瓷珠及保護劑充分混勻。確保所有瓷珠都浸沒在液體中，微生物和保護劑充分吸附到瓷珠的微孔里。

靜置片刻（約5-10分鐘），讓吸附更充分。

5、移除多余液體：

這是非常關鍵的一步！

在無菌操作臺中，小心打開內蓋（篩網蓋）。用無菌移液管或無菌巴斯德吸管，盡可能徹底地吸出管內的多余液體。吸液時避免觸碰瓷珠。

目標是只留下濕潤但不滴液的瓷珠。殘留過多液體在冷凍時會形成大冰晶，嚴重損傷細胞，顯著降低存活率。

5、蓋緊與標記：

菌株名稱/編號

保存日期

操作者姓名/縮寫

批次/項目號（可選）

迅速蓋緊內蓋（篩網蓋）。再蓋緊外蓋，確保雙重密封。

立即用防水、防凍、防有機溶劑的記號筆（或專用標簽）清晰標記管身。信息必須包括：

強烈建議： 在管蓋上和管身都做標記，以防管身標簽磨損脫落。同時做好詳細的電子或紙質記錄。

7、冷凍保存：

將標記好的瓷珠管立即放入-70℃至 -80℃超低溫冰箱或液氮氣相中進行長期保存。

避免使用 -20℃ 冰箱！ 這個溫度不足以長期穩定保存大多數微生物，冰晶損傷嚴重，存活率會隨時間急劇下降。

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8、復蘇使用：

從超低溫環境中取出所需菌株的瓷珠管。全程佩戴低溫防護手套，防止凍傷。

迅速打開外蓋和內蓋（篩網蓋）。

用預冷的無菌鑷子或無菌牙簽（或用無菌接種環在管口內壁輕敲），取出一顆瓷珠。注意：切勿讓剩余的瓷珠在室溫下解凍！

立即將取出的這顆瓷珠在適宜的固體培養基（平板）上滾動劃線，或投入適宜的液體培養基中。

迅速蓋緊瓷珠管的內蓋和外蓋，并立即放回超低溫環境。 盡量減少管內剩余瓷珠暴露在室溫下的時間（最好在1分鐘內完成）。

將接種的平板或液體培養基置于適宜的溫度下培養。

復蘇后，按常規方法進行純化和鑒定。

關鍵注意事項：

1、無菌操作：全程嚴格無菌操作是防止污染、保證菌種純度的基礎。必須在生物安全柜或超凈工作臺中進行。

2、菌株狀態： 使用對數生長期后期、活力旺盛的純培養物。陳舊培養物或狀態不佳的菌種保存效果差。

3、菌懸液濃度：濃度是成功的關鍵！ 必須達到高濃度（≥ 0.5 麥氏單位）。濃度不足會導致復蘇失敗或生長緩慢。準確比濁。

4、徹底移除多余液體： 這是防止冰晶損傷的最重要步驟之一。殘留液體越多，冷凍損傷越嚴重，存活率越低。務必吸到瓷珠濕潤但不滴液的狀態。

5、立即冷凍： 混合吸附完成后，應盡快完成標記并放入超低溫環境。避免在室溫下長時間放置。

6、保存溫度：必須使用 -70℃ 或更低的溫度（-80℃最佳）或液氮氣相保存。 -20℃冰箱僅適用于極短期的臨時存放（幾天到幾周），長期保存效果極差。

7、避免反復凍融：

絕對禁止將整管瓷珠反復取出室溫解凍再凍回去！這會導致管內剩余瓷珠上的微生物反復經歷凍融循環而死亡。

每次復蘇只取出一顆瓷珠，并立即將主保存管放回超低溫環境。

一顆瓷珠理論上可供多次復蘇使用（只要主管保存得當），但實際中通常一顆珠復蘇一次培養物。

8、正確標記： 使用永久性標記，清晰標注所有關鍵信息（菌株、日期、操作者）。雙標記（管身+管蓋）更保險。詳細記錄必不可少。

9、適用性： 此方法對絕大多數細菌和酵母效果很好。但對部分真菌（尤其是絲狀真菌、產孢真菌）、某些挑剔菌、嚴格厭氧菌、螺旋體等效果可能不佳或不適用。對于這類微生物，凍干法或液氮保存可能是更好的選擇。使用前查閱文獻或咨詢供應商。

10、復蘇速度： 取出瓷珠后，應立即將其接種到培養基上。瓷珠在室溫下會迅速解凍，延遲接種可能影響復蘇效率。

11、定期檢查： 雖然瓷珠法保存期很長（許多菌株可保存數年甚至十幾年），但建議對新保存的重要菌株或長期保存的菌株進行定期的存活率測試和純度驗證（例如每年一次）。

12、商業試劑盒： 不同品牌的瓷珠保存管配方和操作細節可能略有差異。務必仔細閱讀并遵循您所使用的特定產品的說明書。

13、生物安全： 操作病原微生物時，必須遵守相應的生物安全等級（BSL）要求和防護措施。

瓷珠菌種保存法因其操作簡便、保存期長、復蘇快速且能避免反復凍融主管的優點，已成為實驗室菌種保藏的常用方法。成功的關鍵在于：高濃度菌懸液、徹底移除多余液體、立即超低溫冷凍保存、以及復蘇時只取單顆珠并迅速放回主保存管。 嚴格遵守操作步驟和注意事項，可以有效地長期保存寶貴的微生物資源。