微生物實驗室常用染色方法及判讀標準
一、 基礎與核心：革蘭氏染色
革蘭氏染色是微生物學中最重要、應用最廣泛的鑒別染色法，是所有微生物檢驗工作者的基本功。
原理： 基于細菌細胞壁結構的不同。革蘭氏陽性菌（G?）的細胞壁肽聚糖層厚，經結晶紫和碘液染色后形成不易被乙醇脫色的復合物；而革蘭氏陰性菌（G?）細胞壁肽聚糖層薄，外膜脂質含量高，易被乙醇脫色。
染色步驟（四步法）：
初染： 結晶紫染液，1分鐘，水洗。
媒染： 碘液，1分鐘，水洗。
脫色：關鍵步驟！ 95%乙醇或丙酮乙醇，快速脫色（約30秒），立即水洗。
復染： 沙黃或復紅染液，1分鐘，水洗，吸干后鏡檢。
判讀標準：
革蘭氏陽性菌（G?）： 菌體呈藍紫色。常見菌如：金黃色葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、炭疽桿菌等。
革蘭氏陰性菌（G?）： 菌體呈紅色或粉紅色。常見菌如：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、淋病奈瑟菌等。
臨床意義：
初步鑒別細菌大類，指導臨床經驗性用藥。
評估標本是否合格（如痰標本中鱗狀上皮細胞與白細胞的數量比）。
觀察細菌的形態（球菌、桿菌）、排列方式（成堆、鏈狀、成雙）等。
二、 抗酸染色與熒光染色
主要用于鑒定分枝桿菌屬（如結核分枝桿菌）和諾卡菌等具有特殊細胞壁（含大量分枝菌酸）的細菌。
原理： 菌體中的分枝菌酸與石炭酸復紅結合后，能抵抗強酸的脫色，故稱“抗酸菌”。
方法：
齊-尼染色法：
初染： 石炭酸復紅加熱染色5分鐘，水洗。
脫色： 關鍵步驟！ 3%鹽酸乙醇脫色至無色或淡粉色，水洗。
復染： 亞甲藍染液，30秒，水洗，吸干鏡檢。
金胺O/羅丹明熒光染色： 更靈敏，適用于篩查。
判讀標準：
齊-尼法： 抗酸桿菌呈紅色細長桿菌，常呈束狀或分枝狀排列；背景及其他菌呈藍色。
報告方式： 根據鏡檢視野菌量，報告“-”至“4+”的不同等級。
熒光法： 在熒光顯微鏡下，抗酸桿菌呈亮黃色或橙黃色熒光。
臨床意義： 是診斷結核病和麻風病的關鍵實驗室檢查。
三、 特殊結構染色
1. 莢膜染色
原理： 莢膜為多糖類物質，不易著色，通常采用負染法，使菌體和背景著色，莢膜在中間呈透明圈。
方法： 印度墨汁法或Hiss硫酸銅法。
判讀標準： 在菌體周圍看到無色或淡紫色的透明圈（背景為黑色或深色），即為莢膜。常見于肺炎克雷伯菌、隱球菌等。
2. 芽孢染色
原理： 芽孢壁厚、透性低，普通染色不易著染，需采用強染力加熱法。
方法： Schaeffer-Fulton法。
判讀標準： 芽孢呈綠色，菌體呈紅色。常見于炭疽桿菌、破傷風梭菌、氣性壞疽病原菌等。
3. 鞭毛染色
原理： 鞭毛極細，需用媒染劑使其沉淀變粗后再染色。
方法： 硝酸銀法或利夫森氏法。
判讀標準： 在菌體周圍看到細長的絲狀物（鞭毛）。用于觀察細菌的動力和鞭毛數量（周毛菌、端毛菌等）。
4. 異染顆粒染色
原理： 某些細菌胞質內含有偏磷酸鹽顆粒，可用特殊染色法染出與菌體不同的顏色。
方法： 阿爾伯特法。
判讀標準： 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色。是鑒定白喉棒狀桿菌的重要特征。
四、 真菌染色
1. 墨汁負染
目的： 主要用于檢測新型隱球菌的厚莢膜。
判讀標準： 在黑色背景中，可見圓形菌體，外圍有一層寬闊、發亮的透明莢膜。
2. 乳酸酚棉藍染色
目的： 真菌學常規染色，既能染色又能保持真菌形態。
判讀標準： 真菌菌絲和孢子被染成藍色。便于觀察菌絲有無隔膜、分生孢子的形態等。
3. 過碘酸希夫染色（PAS）
目的： 用于組織病理切片中的真菌染色，原理是真菌細胞壁多糖與希夫試劑反應。
判讀標準： 真菌被染成鮮紅色或紫紅色，背景為綠色，對比鮮明。
五、 其他重要染色
一種非特異性的真菌染色，能與真菌細胞壁的幾丁質結合，在熒光顯微鏡下發出亮藍色熒光，靈敏度極高。
主要用于血液寄生蟲（瘧原蟲、巴貝斯蟲等）和細胞形態學檢查，也用于某些細胞內細菌（如衣原體包涵體）的觀察。
總結與質量控制
| 染色方法 | 主要用途 | 關鍵顏色特征 | 臨床意義 |
|---|---|---|---|
| 革蘭氏染色 | 細菌分類、形態觀察 | G?：藍紫色； G?：紅色 | 細菌鑒定第一步，指導用藥 |
| 抗酸染色 | 檢測分枝桿菌、諾卡菌 | 抗酸菌：紅色； 背景：藍色 | 診斷結核、麻風 |
| 莢膜染色 | 觀察莢膜 | 莢膜：透明圈； 背景：深色 | 鑒定肺炎克雷伯菌、隱球菌 |
| 芽孢染色 | 觀察芽孢 | 芽孢：綠色； 菌體：紅色 | 鑒定梭菌屬、炭疽桿菌 |
| 異染顆粒染色 | 檢測異染顆粒 | 顆粒：藍黑色； 菌體：綠色 | 鑒定白喉棒狀桿菌 |
| 墨汁負染 | 檢測隱球菌莢膜 | 莢膜：透明圈； 背景：黑色 | 診斷隱球菌腦膜炎 |
質量控制要點：
革蘭氏染色： 每日用金黃色葡萄球菌（G?）和大腸埃希菌（G?）做質控。
抗酸染色： 需用結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌做陽性對照。
染液與試劑： 定期更換，避免失效。
操作規范： 尤其是脫色時間，需嚴格把握。
