微生物染色實驗實操：革蘭氏染色 / 芽孢染色步驟 + 結果觀察
實驗前準備
1.菌種：
革蘭氏陽性菌：例如金黃色葡萄球菌
革蘭氏陰性菌：例如大腸桿菌
產芽孢菌：例如枯草芽孢桿菌
2.染料與試劑：
革蘭氏染色液：結晶紫、碘液、95%酒精（脫色劑）、沙黃或稀釋石炭酸復紅（復染劑）
芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液
3.儀器與耗材：
顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈、洗瓶、鑷子、染色架、香柏油、擦鏡紙
4.安全注意事項：
穿實驗服，戴手套。
使用酒精燈時注意防火，操作完畢立即熄滅。
處理細菌培養物時遵循無菌操作原則，避免污染和感染。
廢棄玻片應放入消毒缸中。
第一部分：革蘭氏染色
革蘭氏染色是細菌學中最重要的鑒別染色法，可將絕大多數細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類。
操作步驟
第一步：涂片制備
標記：取一張潔凈載玻片，用記號筆在背面標記區域（如“G+”和“G-”）。
加水：在每個標記區域中央滴一小滴無菌水。
接種：用滅菌冷卻后的接種環，分別挑取少量菌苔，在水滴中輕輕涂抹開，形成一層薄而均勻的菌膜。
固定：讓涂片在空氣中自然干燥。然后，將載玻片菌膜面向上，快速通過酒精燈火焰2-3次進行熱固定。目的是殺死細菌，使其牢固附著在玻片上。
第二步：初染 - 結晶紫
用結晶紫染液覆蓋整個菌膜。
染色1分鐘。
用細緩水流從玻片一側輕輕沖洗，洗去多余染液。
第三步：媒染 - 碘液
用碘液覆蓋菌膜。
媒染1分鐘。
用水輕輕沖洗。
第四步：脫色 - 95%酒精（最關鍵的一步）
將玻片傾斜，用滴流法脫色。用95%酒精連續沖洗菌膜，直到流下的酒精幾乎無色或呈淡紫色為止。
時間非常關鍵：通常約為 20-30秒。過度脫色會導致陽性菌被誤判為陰性；脫色不足則會導致陰性菌被誤判為陽性。
立即用水輕輕沖洗，終止脫色。
第五步：復染 - 沙黃
用沙黃染液覆蓋菌膜。
復染1分鐘。
用水輕輕沖洗。
用濾紙輕輕吸干水分，或置于空氣中自然晾干。
結果觀察
滴油鏡檢：在干燥的菌膜上滴一滴香柏油，使用油鏡觀察。
結果判讀：
原理：細胞壁肽聚糖層薄，脂質含量高，酒精溶解了外膜的脂質，使得結晶紫-碘復合物被洗脫，從而被沙黃復染成紅色。
原理：細胞壁肽聚糖層厚，交聯緊密，與結晶紫-碘復合物結合牢固，不易被酒精脫色。
革蘭氏陽性菌：菌體呈藍紫色。
革蘭氏陰性菌：菌體呈紅色或粉紅色。
第二部分：芽孢染色
芽孢是某些細菌在不利環境下形成的休眠體，具有厚而致密的壁，普通染色法不易著色。芽孢染色法通過強染劑和加熱促使染料進入芽孢，再通過脫色區分芽孢和菌體。
操作步驟
第一步：涂片制備
與革蘭氏染色相同，制備枯草芽孢桿菌的涂片并進行熱固定。
第二步：初染 - 孔雀綠
用孔雀綠染液完全覆蓋菌膜。
加熱染色：手持玻片，在酒精燈火焰上方微微加熱，使染液冒蒸汽但切勿煮沸或蒸干。加熱過程中隨時添加染液，保持玻片濕潤。
持續5-7分鐘。加熱能幫助染料穿透芽孢的致密結構。
待玻片冷卻后，用細緩水流徹底沖洗。
第三步：脫色 - 水
用自來水輕輕沖洗，直到流下的水無色或呈淡綠色。此步是為了脫去菌體上的顏色，而芽孢內的染料因其結合緊密不易被洗脫。
第四步：復染 - 沙黃
用沙黃染液覆蓋菌膜。
復染1-2分鐘。
用水輕輕沖洗。
用濾紙吸干或自然晾干。
結果觀察
滴油鏡檢：使用油鏡觀察。
結果判讀：
芽孢：呈亮綠色（或初染劑的顏色）。
菌體：呈紅色（復染劑的顏色）。
原理：孔雀綠在加熱條件下能進入芽孢和菌體，但冷卻后，菌體內的孔雀綠被水洗脫，而芽孢內的染料則被保留。隨后沙黃將菌體復染成紅色，形成鮮明對比。
常見問題
| 問題 | ||
|---|---|---|
革蘭氏染色不理想 | ||
陽性菌呈紅色 | 脫色過度；菌種老化（失去細胞壁完整性） | 嚴格控制脫色時間（20-30秒）；使用新鮮培養物（18-24小時） |
陰性菌呈紫色 | 脫色不足；涂片過厚 | 延長脫色時間；制備更薄的菌膜 |
染色結果不均一 | 涂片不均勻；水洗水流過猛 | 確保菌膜薄而均勻；輕柔水洗 |
芽孢染色不理想 | ||
芽孢不著色 | 加熱不足；染色時間太短 | 確保加熱至冒蒸汽并維持足夠時間 |
菌體背景過深 | 脫色（水洗）不徹底 | 延長水洗時間，徹底沖洗 |
看不到芽孢 | 菌種不產孢或產孢率低 | 使用專用產孢培養基或延長培養時間（如培養48-72小時） |
總結
通過這兩個經典的染色實驗，你不僅能夠掌握微生物學的基本操作技能，還能深刻理解細菌細胞結構（如細胞壁、芽孢）與其生理特性及染色行為之間的關系。
