生物素-親和素組合

經(jīng)常做免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員會(huì)好奇，生物素與親和素系統(tǒng)總在各種檢測(cè)中出現(xiàn)，它們幾乎霸占了各種“信號(hào)放大”的不同場(chǎng)合，在Elisa實(shí)驗(yàn)中絕對(duì)是主角般的存在。

Part.01

 趣味發(fā)現(xiàn)

這么強(qiáng)大的工具要從雞蛋清說(shuō)起，也是我們?nèi)粘Ｉ钪卸鴣?lái)。20世紀(jì)初，科學(xué)家用大量生蛋清作為飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如大鼠或小雞）時(shí)，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、皮膚炎癥、脫毛甚至死亡等中毒癥狀。

煮熟之后，又發(fā)現(xiàn)這種“毒性”不復(fù)存在了，聰明的你肯定要下結(jié)論，所以生雞蛋不能吃吧，但是，科學(xué)家們懷疑雞蛋內(nèi)存在某種毒素（后來(lái)證明是生物素），本著探索而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那笾彩窍群蠓蛛x并命名了生物素（Biotin，又稱微生物B7）和親和素(Avidin)，從此其作用機(jī)制迅速被清新闡明。

最重要的是，科學(xué)家后來(lái)發(fā)現(xiàn)一個(gè)親和素分子能結(jié)合四個(gè)生物素分子，這種強(qiáng)度在自然界中極為罕見(jiàn)，立刻引起了生物化學(xué)家的極大興趣，從此其巧妙的應(yīng)用如同開掛，在學(xué)術(shù)界瘋狂傳開。

（親和素與生物素結(jié)合）

Part.02

 結(jié)合機(jī)制 

該系統(tǒng)內(nèi)在業(yè)界廣為人知，離不開后續(xù)鏈霉親和素發(fā)現(xiàn)以及抗體、蛋白標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，所謂天時(shí)地利人和。

親和素與鏈霉親和素區(qū)別

親和素是一種堿性糖蛋白，其高pI使得它在中性pH環(huán)境下帶大量正電荷，容易與細(xì)胞膜、核酸等帶負(fù)電的組分發(fā)生靜電吸附，導(dǎo)致較高的非特異性背景。其糖基（約占質(zhì)量的10%）還可能和某些組織樣本中的凝集素結(jié)合，進(jìn)一步增加背景。

鏈霉親和素是非糖基化蛋白，其等電點(diǎn)接近中性，因此靜電相互作用引起的非特異性結(jié)合非常低，這在免疫組化等應(yīng)用中至關(guān)重要。

（鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)）

親和素與生物素之間的結(jié)合力之所以如此強(qiáng)大，并非源于單一因素，而是多種分子作用力協(xié)同配合的結(jié)果。

首先，他們之間的結(jié)合本質(zhì)上是一種靜電引力。鏈霉親和素的每一個(gè)生物素結(jié)合口袋都是一個(gè)深長(zhǎng)的隧道狀結(jié)構(gòu)，生物素分子恰好可以完全嵌入到這個(gè)口袋中，該環(huán)會(huì)像“蓋子”一樣關(guān)閉，將生物素包裹在內(nèi)部。這一構(gòu)象變化物理上阻礙了生物素的解離，使得結(jié)合幾乎不可逆。

其次，結(jié)合口袋內(nèi)有多個(gè)氨基酸殘基（如 Asn23、Ser27、Tyr43 等）與生物素的咪唑酮環(huán)上的羰基和氮原子形成廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這是穩(wěn)定結(jié)合的核心。

總之，在各種力的加持之下，它們之間解離變得異常困難，因此成了生物界中結(jié)合最強(qiáng)的存在。

Part.03

 主要應(yīng)用 

由于生物素-親和素之間的結(jié)合關(guān)系，它最常被用于信號(hào)放大，提高檢測(cè)的靈敏度。與此同時(shí)，鏈霉親和素可以與各種基團(tuán)以及信號(hào)分子結(jié)合，這個(gè)設(shè)計(jì)使得其在免疫反應(yīng)中如魚得水。

在Elisa實(shí)驗(yàn)中，它用于檢測(cè)抗原或抗體，過(guò)程中使用生物素化的二抗和酶標(biāo)記的鏈霉親和素，可以比傳統(tǒng)ELISA靈敏度提高數(shù)倍至數(shù)十倍。

若到分子生物學(xué)內(nèi)，它搖身一變，將生物素標(biāo)記的核苷酸摻入DNA探針中，通過(guò)酶標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，用于Southern blot、Northern blot、原位雜交和基因芯片。

細(xì)胞學(xué)研究也很常見(jiàn)，用生物素化抗體和熒光染料標(biāo)記的鏈霉親和素，可以高效地進(jìn)行多色分析，尤其適用于檢測(cè)低豐度的細(xì)胞表面標(biāo)志物；組織或細(xì)胞切片中抗原的定位和檢測(cè)，信號(hào)強(qiáng)、背景清晰；

即使在細(xì)胞分選，也不乏其身影：與磁激活細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)合，通過(guò)生物素化抗體和鏈霉親和素磁珠，從混合細(xì)胞群中特異性分離目標(biāo)細(xì)胞。